إذابة خطوط خلايا PRF

1. قم بتذويب الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
2. امسح الجزء الخارجي من القارورة باستخدام الإيثانول 70%.
3. انقل الخلايا المذابة إلى قارورة T25 تحتوي على 5 مل من وسط النمو.
4. ضع القارورة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل.
5. في اليوم التالي، قم بالمراقبة تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا قد التصقت.
6. قم بإزالة الوسائط واستبدالها بوسائل نمو جديدة.

زراعة خلايا PRF

1. ينبغي تقسيم الخلايا عند التقاءها.
2. لتقسيم الخلايا (الأحجام المعطاة تفترض وجود الخلايا في T25):
   أ) باستخدام تقنية معقمة، قم بإزالة الوسائط واشطف القارورة بـ 2-3 مل من HBSS المعقم. قم بإزالة HBSS والتخلص منه.
   ب) أضف 1 مل من التربسين واحتضن لمدة 2-3 دقائق. يجب فحص الخلايا تحت المجهر المقلوب لتحديد ما إذا كانت قد بدأت في التكتل والارتفاع والطفو. إذا لم تنفصل الخلايا بعد 3 دقائق، يمكنك الحضن لمدة 1-2 دقيقة أخرى.
   ج) أحكم إغلاق الغطاء وحرك القارورة برفق من جانب إلى آخر لإخراج جميع الخلايا. يمكن قرع القارورة برفق على أحد الجانبين لإخراج الخلايا إذا لزم الأمر.
   د) أضف 4 مل من الوسط الجديد إلى القارورة بمجرد أن تطفو الخلايا لتعطيل التربسين. اشطف جوانب القارورة عدة مرات بالوسط الجديد لغسل جميع الخلايا من البلاستيك وإدخالها إلى المحلول. أزل جميع الخلايا السائلة التي تحتوي على الخلايا وانقلها إلى مخروطي الشكل سعة 15 مل (أو 50 مل إذا كنت تقوم بتجميع 3 قوارير أو أكثر).
   هـ) باستخدام تقنية معقمة، قم بإزالة جزء صغير لعده على جهاز عداد الكريات الدموية.
   و) أثناء عد الخلايا، يجب تدوير بقية المحلول في جهاز الطرد المركزي السريري لمدة 5 دقائق بسرعة 1000 دورة في الدقيقة.
3. بعد حساب عدد خلاياك، خلايا اللوحة عند 2.5 × 10⁵ خلايا لكل فلتر T25 العلوي.
4. يجب تغذية الخلايا كل 2-3 أيام بوسط نمو طازج.

التجميد:

يجب تجميد الخلايا على درجة حرارة لا تقل عن 5 × 10⁵ خلايا/مل/قارورة مبردة في وسط نمو يحتوي على 10% DMSO و30% FBS ثم توضع في حجرة تجميد الأيزوبروبانول عند درجة حرارة -80 درجة مئوية طوال الليل. تنقل إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي.

بروتوكول إعادة زراعة الخلايا الليفية وتجميدها