1. معلومات أساسية عن الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات للأشخاص غير المتخصصين

الخلايا الجذعية هي خلايا "غير ناضجة" لم تتعهد بعد بالتحول إلى أي نوع من الخلايا. وهي مرنة لأنها تمتلك القدرة على التطور إلى أنواع عديدة مختلفة من الخلايا الناضجة في الجسم، مثل الخلايا التي تشكل القلب أو الأوعية الدموية، والأنسجة والأعضاء الأخرى. في عام 2007، اكتشف الباحثون استراتيجية لإنشاء الخلايا الجذعية في المختبر عن طريق إعادة برمجة الخلايا البالغة الناضجة التي نزرعها عادة لأغراض البحث.^{1, 2} تُسمى هذه الخلايا الجذعية التي تم إنشاؤها صناعيًا بالخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة ("iPSCs"). بالنسبة لمجال مرض بروجيريا، يعد هذا اختراقًا هائلاً. لأول مرة، يمكن للعلماء الآن صنع خلايا جذعية لمرض بروجيريا وطرح أسئلة حول كيفية عمل الخلايا الجذعية وتطورها في مرض بروجيريا. في السابق لم يكن هناك مصدر لخلايا جذعية بشرية لمرض بروجيريا، وبالتالي كان هناك فراغ في المعلومات حول كيفية عمل خلايا جذعية لمرض بروجيريا مقارنة بالخلايا الجذعية من الأشخاص الذين لا يعانون من مرض بروجيريا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للعلماء إعادة برمجة خلايا جذع بروجيريا لإنشاء، لأول مرة، أوعية دموية ناضجة لمرض بروجيريا وخلايا قلب وأنواع أخرى من الخلايا. حتى الآن، لم يكن هناك مصدر لخلايا قلب أو أوعية دموية بشرية لمرض بروجيريا.  يمكننا الآن أن نسأل المفتاح أسئلة حول أمراض القلب التي تؤدي إلى الموت المبكر لدى مرضى الشيخوخة المبكرة بسبب النوبات القلبية والسكتات الدماغية. يمكننا مقارنة هذه الاكتشافات بأمراض القلب والشيخوخة لدى عامة الناس واكتشاف المزيد حول ما يؤثر على الشيخوخة لدى كل منا. وقد تم بالفعل نشر العديد من الدراسات الممتازة باستخدام الخلايا الجذعية لمرض الشيخوخة المبكرة.^3-5  هدفنا في مؤسسة أبحاث الشيخوخة المبكرة هو تسهيل المزيد من الاكتشافات باستخدام هذه الأداة القيمة. للحصول على مقدمة عن الخلايا الجذعية، يرجى زيارة موقع الحكومة الأمريكية على الإنترنت: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. الغرض من توليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) وتوزيعها بواسطة مؤسسة أبحاث الشيخوخة المبكرة

تتمثل مهمة مؤسسة أبحاث بروجيريا في اكتشاف العلاجات والشفاء من متلازمة هتشينسون جيلفورد بروجيريا والاضطرابات المرتبطة بالشيخوخة. في عام 2009، دخلت مؤسسة أبحاث بروجيريا في تعاون مع فريق من الخبراء من العلماء في جامعة تورنتو، كندا، تحت إشراف الدكتور ويليام ستانفورد، لتوليد خلايا iPSC عالية الجودة من بروجيريا. يشغل الدكتور ستانفورد منصب رئيس أبحاث كندا في علم الأحياء الخلوية الجذعية التكاملية. اعتبارًا من عام 2011، تواصل مؤسسة أبحاث بروجيريا التعاون مع الدكتور ستانفورد في جامعة أوتاوا، كندا حيث يعمل أستاذًا للطب الخلوي والجزيئي، بكلية الطب، وكبير العلماء في مركز سبروت لأبحاث الخلايا الجذعية التابع لمعهد أبحاث مستشفى أوتاوا.

هدفنا هو توفير هذه الأداة القيمة للباحثين في جميع أنحاء العالم. سيتم استخدام أداة البحث الجديدة هذه لتوليد أبحاث جديدة ومبتكرة حول مرض الشيخوخة المبكرة، بالإضافة إلى علاقته بأمراض القلب والشيخوخة.  

3. توليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بمتلازمة هتشينسون جيلفورد بروجيريا (iPSCs)

تم استخلاص الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) باستخدام نقل فيروسي رجعي شبه نمطي لـ VSVG لأربعة عوامل بشرية، Oct4 وSox2 وKlf4 وc-Myc إلى الخلايا الليفية. تم استخلاص مستعمرات الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة على الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs). كان الإجراء المستخدم هو نفس الإجراء الموصوف سابقًا ولكن بدون استخدام EOS reporter (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. مراقبة الجودة: التحقق والتصنيف

لقد خضعت الخطوط المتاحة حاليًا لعدة خطوات للتحقق (انظر ملفات PDF القابلة للتنزيل أدناه):

5. المادة الأولية التي تم استخلاص هذه الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات منها

تم الحصول على الخلايا iPSCs من خطوط الخلايا الليفية غير المحولة من بنك الخلايا والأنسجة PRF.

كانت طريقة التحويل المستخدمة لجميع خطوط iPS هي Retrovirus MKOS.

معرف خط iPSC	طفرة	الجنس والعمر	نوع الخلية الأصلية انقر هنا.	البيانات الداعمة
HGADFN003 iPS 1B	LMNAExon 11، 1824 ج>ت	ذكر 2 سنة 0 شهر	الخلايا الليفية الجلدية هغادفن003	003 اي بي اس 1 بي
HGADFN003 اي بي اس 1 سي	إكسون LMNA رقم 11، 1824 ج>ت	ذكر 2 سنة 0 شهر	الخلايا الليفية الجلدية هغادفن003	003 اي بي اس 1 سي
اتش جي دي اف ان 003 اي بي اس 1دي	إكسون LMNA رقم 11، 1824 ج>ت	ذكر 2 سنة 0 شهر	الخلايا الليفية الجلدية هغادفن003	003 اي بي اس 1 دي
HGADFN167 iPS 1J	LMNA Exon 11، 1824 C>T	ذكر 8 سنوات و 5 أشهر	الخلايا الليفية الجلدية HGADFN167	167 حصان 1ج
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA Exon 11، 1824 C>T	ذكر 8 سنوات و 5 أشهر	الخلايا الليفية الجلدية HGADFN167	167 اي بي اس 1 كيو
HGMDFN090 iPS 1B	أم HGADFN167 (غير متأثرة)	أنثى 37 سنة و 10 أشهر	الخلايا الليفية الجلدية هجمدفن090	090 اي بي اس 1 بي
HGMDFN090 iPS 1C	أم HGADFN167 (غير متأثرة)	أنثى 37 سنة و 10 أشهر	الخلايا الليفية الجلدية هجمدفن090	090 اي بي اس 1 سي
HGFDFN168 iPS1 D2	والد HGADFN167 (غير متأثر)	ذكر 40 سنة 5 أشهر	الخلايا الليفية الجلدية HGFDFN168	168 اي بي اس 1 دي 2
HGFDFN168 iPS1P	والد HGADFN167 (غير متأثر)	ذكر 40 سنة 5 أشهر	الخلايا الليفية الجلدية هغفدفن168	168 اي بي اس 1 بي

6. انضم إلى قائمة البريد الإلكتروني الخاصة بنا للحصول على تحديثات iPSC المستقبلية وخطوط الخلايا الجديدة

نحن نواصل توليد خطوط iPSC. إذا كنت ترغب في الحصول على تحديثات دورية حول iPSCs الموجودة في بنك الخلايا والأنسجة PRF، يرجى الانضمام إلى قائمة البريد الإلكتروني الخاصة بنا بالنقر فوق هنا

7. أسئلة؟

يرجى الاتصال بالدكتور ليزلي جوردون، المدير الطبي، لأي أسئلة أو احتياجات، على لجوردون@progeriaresearch.org أو 978-535-2594

8. طلب خطوط خلايا iPS

في عام 2014، تبنت مؤسسة PRF سياسة عدم إجراء أي تعديلات على اتفاقية النقل والإمداد الخاصة بنا. وهذا نتيجة 12 عامًا من الترتيبات التعاقدية مع 70 فريقًا بحثيًا يعملون في مؤسسات في 14 دولة. وقد أخذت مؤسسة PRF ومستشاروها في الاعتبار القضايا التي نشأت في تلك الفترة الزمنية وقاموا بتحرير الاتفاقية وفقًا لذلك، مما أدى إلى ما نشعر أنه شروط عادلة ومعقولة.

للاستفسارات أو لمؤسسات الحكومة الفيدرالية الأمريكية، يرجى الاتصال بـويندي نوريس على: ونوريس@brownhealth.org أو 401-274-1122 × 48063.

الخطوة 1: استكمال الطلب واتفاقية نقل المواد

طلب واتفاقية للمؤسسات غير الحكومية

اتفاقية نقل المواد للمؤسسات غير الحكومية

الخطوة 2: قم بإرجاع الطلب المكتمل واتفاقية نقل المواد إلى ويندي نوريس على ونوريس@brownhealth.orgبمجرد الموافقة، سوف تتلقى رسالة بريد إلكتروني لتأكيد طلبك وتاريخ الشحن المتوقع. 

الخطوة 3: يقوم مختبر الدكتور ستانفورد حاليًا بتوزيع خطوط في أوعية مجمدة. وسيقوم مختبره بإرسال بريد إلكتروني إليك عند شحن الثقافة، مع معلومات الشحن والتتبع. يتم توجيه الباحثين عديمي الخبرة للحصول على تدريب في دورات متخصصة ضرورية لعمل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية/الخلايا الجذعية متعددة القدرات.

يقدم مركز الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (بإدارة الدكتور ستانفورد) في معهد أبحاث مستشفى أوتاوا تدريبًا فرديًا افتراضيًا حول أساسيات تقنيات زراعة الخلايا الجذعية متعددة القدرات الخاصة بخلايا بروجيريا متعددة القدرات. خيارات التدريب وتنسيقه مرنان حسب مستوى خبرة العلماء.  لمزيد من المعلومات، يرجى إرسال بريد إلكتروني إلى hpscf@ohri.ca.

الخطوة 4: ستقوم جامعة أوتاوا بإرسال فاتورة إليك مباشرة مقابل كل خط iPSC بالإضافة إلى تكاليف البريد السريع، إن وجدت.

9. تحضير وسائط زراعة خلايا HGPS وiPS Control

يجب تغذية الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات والخلايا الجذعية الجنينية بمستحضر mTeSR Plus من شركة Stem Cell Technologies (cat# 5825). يرجى اتباع توصيات المورد فيما يتعلق بالتخزين.

10. تحضير أطباق الماتريجيل

ملحوظة:يجب تنفيذ جميع الخطوات المتعلقة بماتريجيل في أسرع وقت ممكن والبقاء باردة قدر الإمكان.

1. إذابة زجاجة الماتريجيل عند 4°ج. تحقق من شهادة التحليل الخاصة بهذه الدفعة لمعرفة تركيز البروتين فيها.
2. أضف كمية كافية من وسائط DMEM/F12 الباردة إلى مادة الماتريجيل المذابة للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 5 ملغ/مل.
3. اصنعي 1 مل من الماتريجيل المحضر من الخطوة 2 في أنابيب فالكون سعة 15 مل مبردة مسبقًا.
4. تجميد وتخزين جميع الحصص عند درجة حرارة -20°ج.
5. لصنع ألواح ماتريجيل، قم بإزالة جزء واحد من ماتريجيل (1 مل) من -20°ج وأضف 10 مل من DMEM/F12 البارد. امزج جيدًا حتى تذوب الحبيبات (دون تكوين فقاعات، واحرص دائمًا على إبقاء المحلول باردًا).
6. انقلي الخليط إلى أنبوب سعة 50 مل، ثم أضيفي 20 مل من DMEM/F12 البارد (يتم تخفيف 1 مل من عليقة الماتريجيل في 30 مل من DMEM/F12)، واخلطي جيدًا.
7. صفيحة (1 مل/بئر لصفيحة ذات 6 آبار، 0.5 مل/بئر لصفيحة ذات 12 بئر، 0.25 مل/بئر لصفيحة ذات 24 بئر). تأكد من أن المحلول يغطي مساحة السطح بالكامل عن طريق رج الصفيحة برفق. لا تقم بإعادة تجميد أي مادة هلامية متبقية.
8. إذا كنت تستخدم اللوحة على الفور، اترك اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة (أو 30 دقيقة عند 37 درجة فهرنهايت).°ج) راقب مادة الماتريجيل تحت المجهر. يجب أن تكون مادة الماتريجيل موزعة بشكل جيد وليست "متكتلة".
9. إذا كنت تستخدم الأطباق في وقت آخر، قم بلف حافة الطبق بفيلم البارافيلم وقم بتخزينه في درجة حرارة 4°ج لمدة تصل إلى أسبوعين.

ماتريجيل – بي دي/فيشر، cat#CB-40230

DMEM/F12 – تقنيات الحياة، cat#11330-057

الدكتور ويليام ستانفورد-2022

11. إذابة الخلايا الجذعية الجنينية أو الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات (لكل قارورة تبريد)

1. خذ طبق ماتريجيل من 4 درجات مئوية وقم بتسخينه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أو قم بإعداد طبق ماتريجيل جديد (انظر بروتوكول تحضير طبق ماتريجيل).
2. قم بتسخين 4 مل من mTeSR Plus في أنبوب فالكون سعة 15 مل.
3. قم بإزالة الخلايا من خزان النيتروجين السائل وقم بتحريكها في حمام بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يتبقى فقط قطعة صغيرة من الثلج. يجب أن تذوب القارورة في غضون دقيقة إلى دقيقتين. يجب تنفيذ هذه الخطوة بسرعة.
4. أنبوب خلية الإيثانول وأنبوب وسائط الصقر ووضعهما في الغطاء.
5. استخدم 1 مل فم واسع الطرف ببطء أضف الخلايا إلى 4 مل من الوسائط المسخنة مسبقًا (تجنب خلط تعليق الخلايا).
6. قم بالدوران بسرعة 130 درجة لمدة 5 دقائق.
7. إزالة العوالق.
8. أضف 2 مل من وسائط PSC، وباستخدام فوهة واسعة تفتيت التكتلات بلطف. انقل الوسائط إلى بئر واحد من صفيحة مكونة من 6 آبار وأضف 2 ميكرولتر من مثبط ROCK (Y27632، التركيز النهائي 10 ميكرومولر). ضع الصفيحة في بئر واحد مطلي بمادة ماتريجيل (من صفيحة مكونة من 6 آبار).
9. قم بتوزيع الخلايا الصخرية بلطف على نحو متساوٍ، ثم ضعها في حاضنة خالية من الأكسجين (5%O)₂، 10% CO₂). تجنب إزعاج اللوحة لمدة 24 ساعة بعد البذر.

   ملحوظة: من المهم جدًا تجنب التكتل المفرط أو السحب العنيف. يمكن أن يؤدي هذا إلى تقليل معدل البقاء بشكل كبير. يجب أن تظل الخلايا في كتل كبيرة يتراوح حجمها بين 100 و300 خلية في وقت الزرع. مع مراعاة اللطف، حاول العمل بسرعة بمجرد إذابة الخلايا لتقليل الوقت الذي تظل فيه على اتصال بالمواد الواقية من التجمد.​

10. قم بإزالة الوسائط بعد 24 ساعة وأضف 2 مل من وسائط PSC (للوحة ذات 6 آبار، و1 مل لـ 12 بئرًا و0.5 مل لـ 24 بئرًا). راجع بروتوكول الحصاد والعناية بـ hESC/iPSC.

وسائل الاعلام PSC

mTeSR Plus من Stem Cell Technologies (cat# 5825). يرجى اتباع توصيات المورد فيما يتعلق بالتخزين.

ما هو ROCK Inhibitor Y27632؟

مثبط ROCK Y27632 هو مثبط انتقائي للكيناز المرتبط بـ Rho p160 ROCK. يمنع العلاج بمثبط ROCK Y27632 موت الخلايا المبرمج الناتج عن تفكك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) والخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (iPSC)، مما يزيد من معدل البقاء ويحافظ على تعدد القدرات أثناء إعادة زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية وإذابتها. كما ثبت أن مثبط ROCK Y27632 يعزز معدل بقاء الخلايا الجذعية أثناء التجميد. لاحظ أن أجزاء مثبط Rock حساسة للضوء ودورات التجميد والذوبان المتكررة. تأكد من استخدام هذه الأجزاء خلال مدة الصلاحية الموصى بها من قبل المورد.

الدكتور ويليام ستانفورد-2022

12. حصاد ورعاية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية/الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات

1. في اليوم التالي لإذابة الخلايا، ألق نظرة عليها تحت المجهر لتحديد معدل البقاء. ملاحظة: من الطبيعي ملاحظة عدد كبير من الخلايا غير الملتصقة. طالما أن بعض الخلايا ملتصقة، يمكن أن تنشأ منها مستعمرات في غضون 3 إلى 7 أيام.
2. قم بإزالة الوسائط من الآبار واستخدم ماصة لسحب 2 مل (للوحة ذات 6 آبار، و1 مل للوحة ذات 12 بئرًا، و0.5 مل للوحة ذات 24 بئرًا) من وسائط PSC الطازجة والدافئة لكل بئر. أعد اللوحة إلى الحاضنة.
3. يتم تغذية الخلايا حتى تصل إلى 60-70% (اتبع توصيات المورد).
4. اعتبارًا من اليوم الثاني، يجب مراقبة الخلايا وتنظيفها من أي خلايا متمايزة قد تكون في طور النمو.
5. لتنظيف الخلايا، استخدم غطاء الالتقاط وقم بكشط الخلايا المتمايزة باستخدام طرف الماصة.
6. بمجرد تنظيف الخلايا، قم بتغيير الوسائط كما فعلت في الخطوات المذكورة أعلاه.

(انظر تجميد hESC/iPSC أو تمرير hESC/iPSC)

ملحوظة:

لقد ثبت أن وسائط الخلايا الجذعية متعددة القدرات أكثر كفاءة في بيئة خالية من الأكسجين. كما لاحظنا أن التمايز يحدث بشكل أقل عندما تُزرع الخلايا في حاضنات خالية من الأكسجين مقارنة بالحاضنات الطبيعية. وأخيرًا، تتمتع الخلايا المزروعة بالبذور بمعدل بقاء أفضل عند استخدام حاضنة خالية من الأكسجين.

نورموكسيك: 37°ج، 21% O₂، 5% CO₂

نقص الأكسجين: 37°ج، 5%O₂، 10% CO₂

الدكتور ويليام ستانفورد-2022

13. تمرير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية/الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات

1. أضف 2 مل من وسائط PSC إلى لوحة مطلية بمادة ماتريجيل مكونة من 6 آبار ثم ضعها جانبًا.
2. خذ اللوحة المراد تمريرها وأزل الوسائط من البئر واغسلها مرة واحدة بـ 1 مل من PBS(-/-).
3. أضف 1 مل من محلول EDTA إلى البئر واتركه لمدة 3-4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لا تحرك اللوحة حيث يمكن أن تبدأ الخلايا في الانفصال.
4. قم بإزالة محلول EDTA وأضف 1 مل من وسط PSC. لا تترك EDTA على الخلايا لأكثر من 4 دقائق لأن هذا سيؤدي إلى رفع الخلايا.
5. اكشط الخلايا باستخدام مكشطة الخلايا وقسم الخلايا بين 6 آبار في الطبق الذي يحتوي على وسائط الخلايا الجذعية متعددة القدرات. تجنب التكسير المفرط لقطع المستعمرة وحاول أن تكون لطيفًا في الكشط. حاول الحفاظ على الخلايا في قطع كبيرة. استخدم طرف ماصة ذات فوهة واسعة لتفتيت التكتلات إذا لزم الأمر. قد يؤدي التكسير المفرط للخلايا إلى موت الخلايا أو التمايز التلقائي المفرط بعد المرور.
6. حضن عند 37°ج- بعد توزيع الخلايا بالتساوي في كل بئر (اهتزاز على شكل 8 أرقام أو حرف L). تجنب تحريك اللوحة لمدة 24 ساعة بعد المرور.

ملحوظة:بمجرد كشط الخلايا، يجب عليك نقلها إلى اللوحة الجديدة في أسرع وقت ممكن لأن الخلايا سوف تلتصق مرة أخرى بسرعة (في غضون 5 دقائق).

إذا تُركت مادة EDTA على الخلايا لأكثر من 4 دقائق، فقد تبدأ الخلايا في الانفصال. إذا حدث هذا، فما عليك سوى جمع الخلايا في وعاء فالكون سعة 15 مل مع 4 مل من وسائط PSC. قم بتدوير الخلايا بسرعة 130 rcf لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الحبيبات مع 1 مل من الوسائط وقسمها بالتساوي بين صفيحة مطلية بمادة ماتريجيل مكونة من 6 آبار (160 ميكرولتر لكل بئر).

محلول EDTA: أضف 500 ميكرولتر من 0.5 مولار EDTA (درجة حموضة 8.0) إلى 500 مل من DPBS (-/-). أضف 0.9 جرام من كلوريد الصوديوم. قم بتصفية المحلول لتعقيمه وتخزينه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

من الصحيفة:

مرور وتوسع مستعمرات الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات عن طريق التفكك الخالي من الإنزيمات في ظروف زراعة محددة كيميائيًا

جانيت بيرز,¹ دانييل ر. جولبرانسون,^2,3 نيكول جورج,⁴لورين آي. سينيسكالتشي,¹ جيفري جونز,^4,5 جيمس أ. تومسون,^2,3,6 و جوكاي تشين^1,2

14. تجميد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية/الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات

1. قم بتشغيل Bio-Cool (الفريزر ذو المعدل المتحكم) واضبط درجة الحرارة على -7 درجة مئوية.
2. قم بإزالة الخلايا من الحاضنة ولاحظ التقاء الخلايا وشكلها تحت المجهر.
3. إذا كانت الآبار متجمعة 70%، قم بإزالة الوسائط القديمة واغسلها مرة واحدة باستخدام PBS(-/-) ثم أضف 1 مل من محلول EDTA (انظر المرور بمحلول EDTA) لكل بئر.
4. حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 دقائق.
5. قم باستنشاق محلول EDTA وأضف 1 مل من وسط mFreSR البارد (cat#05855، Stem Cell Technologies).
6. استخدم مكشطة الخلايا لرفع الخلايا برفق. احرص على إبقاء الخلايا في قطع كبيرة قدر الإمكان وتجنب سحبها لأعلى ولأسفل.
7. انقل الخلايا/mFreSR إلى أنبوب تبريد باستخدام طرف ذو فوهة واسعة. احتفظ بالقوارير على الثلج حتى تصبح جاهزة للخطوة 8.
8. ضع الأنابيب في Bio-Cool واحضنها لمدة 10 دقائق.
9. احصل على النيتروجين السائل.
10. بعد 10 دقائق، قم بتلقيح الخلايا عن طريق غمس ملعقة مسطحة في النيتروجين السائل ولمس جانب القارورة المبردة لمدة 10-30 ثانية تقريبًا أو حتى ترى تشكل بلورة على جانب القارورة المبردة.
11. ابدأ البرنامج 1 بالضغط على زر "PROG" وانتقل عبر البرنامج بالضغط على الزر مرة أخرى ويجب أن ترى معدل 0.5 درجة مئوية / دقيقة، ثم اضغط على "RUN".
12. بمجرد أن تصل درجة الحرارة إلى -65 درجة مئوية، يمكن نقل أنابيب التبريد وتخزينها في النيتروجين السائل.

البدائل

هناك خيار آخر يتمثل في وضع أنابيب التبريد في حاوية تجميد (Biocision-CoolCell) وتخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية طوال الليل. ثم نقل أنابيب التبريد إلى النيتروجين السائل (الطور السائل أو البخاري) في اليوم التالي.

الدكتور ويليام ستانفورد-2022