1. অ-বিজ্ঞানীর জন্য iPSC পটভূমি তথ্য

স্টেম সেল হল "অপরিপক্ব" কোষ যা এখনও কোনো এক ধরনের কোষে পরিণত হতে প্রতিশ্রুতিবদ্ধ নয়। এগুলি নমনীয় কারণ তাদের দেহে বিভিন্ন ধরণের পরিপক্ক কোষে বিকাশের সম্ভাবনা রয়েছে, যেমন কোষগুলি যা হৃদয় বা রক্তনালী এবং অন্যান্য টিস্যু এবং অঙ্গগুলি তৈরি করে। 2007 সালে, গবেষকরা পরিপক্ক প্রাপ্তবয়স্ক কোষগুলিকে পুনঃপ্রোগ্রামিং করে পরীক্ষাগারে স্টেম সেল তৈরি করার একটি কৌশল আবিষ্কার করেছিলেন যা আমরা সাধারণত গবেষণার উদ্দেশ্যে বৃদ্ধি করি।^{1, 2} . এই কৃত্রিমভাবে তৈরি স্টেম সেলকে বলা হয় Induced Pluripotent স্টেম সেল ("iPSCs")। Progeria ক্ষেত্রের জন্য, এটি একটি বিশাল অগ্রগতি। প্রথমবারের মতো, বিজ্ঞানীরা এখন প্রোজেরিয়া স্টেম সেল তৈরি করতে পারেন এবং প্রোজেরিয়াতে স্টেম সেল কীভাবে কাজ করে এবং বিকাশ করে সে সম্পর্কে প্রশ্ন জিজ্ঞাসা করতে পারেন। পূর্বে মানুষের প্রোজেরিয়া স্টেম সেলের কোন উৎস ছিল না, এবং তাই প্রোজেরিয়া ছাড়া মানুষের স্টেম সেলের তুলনায় প্রোজেরিয়া স্টেম সেলগুলি কীভাবে কাজ করে সে সম্পর্কে তথ্যের একটি শূন্যতা ছিল। এছাড়াও, বিজ্ঞানীরা প্রোজেরিয়া স্টেম সেলগুলিকে পুনরায় প্রোগ্রাম করতে পারেন, প্রথমবারের মতো, পরিপক্ক প্রোজেরিয়া রক্তনালী, হৃৎপিণ্ডের কোষ এবং অন্যান্য কোষের প্রকারগুলি তৈরি করতে। এখন পর্যন্ত, মানুষের প্রোজেরিয়া হার্ট বা রক্তনালী কোষের কোন উৎস ছিল না।  আমরা এখন চাবি জিজ্ঞাসা করতে পারেন হৃদরোগ সম্পর্কে প্রশ্ন যা হার্ট অ্যাটাক এবং স্ট্রোক থেকে প্রোজেরিয়ায় প্রাথমিক মৃত্যু ঘটায়। আমরা এই আবিষ্কারগুলিকে সাধারণ জনগণের হৃদরোগ এবং বার্ধক্যের সাথে তুলনা করতে পারি এবং আমাদের সকলের বার্ধক্যকে কী প্রভাবিত করে সে সম্পর্কে আরও আবিষ্কার করতে পারি। ইতিমধ্যেই প্রোজেরিয়া স্টেম সেল ব্যবহার করে বেশ কিছু চমৎকার গবেষণা প্রকাশিত হয়েছে।^3-5  প্রোজেরিয়া রিসার্চ ফাউন্ডেশনে আমাদের লক্ষ্য এই অমূল্য টুল ব্যবহার করে আরও অনেক আবিষ্কারের সুবিধা দেওয়া। স্টেম সেলগুলিতে প্রাইমারের জন্য, অনুগ্রহ করে এই মার্কিন সরকারের ওয়েবসাইটটি দেখুন: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. প্রজেরিয়া রিসার্চ ফাউন্ডেশন দ্বারা প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল (iPSC) তৈরি এবং বিতরণের উদ্দেশ্য

প্রোজেরিয়া রিসার্চ ফাউন্ডেশনের লক্ষ্য হল হাচিনসন-গিলফোর্ড প্রোজেরিয়া সিন্ড্রোম এবং এর বার্ধক্যজনিত ব্যাধিগুলির চিকিত্সা এবং নিরাময় আবিষ্কার করা। 2009 সালে, PRF উচ্চ মানের Progeria iPSCs তৈরি করতে উইলিয়াম স্ট্যানফোর্ড, পিএইচডি-র নির্দেশনায় কানাডার টরন্টো বিশ্ববিদ্যালয়ের বিজ্ঞানীদের একটি বিশেষজ্ঞ দলের সাথে সহযোগিতায় প্রবেশ করে। ডাঃ স্ট্যানফোর্ড ইন্টিগ্রেটিভ স্টেম সেল বায়োলজিতে কানাডা রিসার্চ চেয়ার। 2011 সাল থেকে, PRF কানাডার অটোয়া বিশ্ববিদ্যালয়ের ডাঃ স্ট্যানফোর্ডের সাথে সহযোগিতা অব্যাহত রেখেছে যেখানে তিনি সেলুলার এবং মলিকুলার মেডিসিনের অধ্যাপক, মেডিসিন অনুষদ এবং অটোয়া হাসপাতাল রিসার্চ ইনস্টিটিউটের স্টেম সেল গবেষণার স্প্রট সেন্টারের সিনিয়র বিজ্ঞানী।

আমাদের লক্ষ্য সারা বিশ্বের গবেষকদের এই অমূল্য টুল প্রদান করা হয়. এই নতুন গবেষণা সরঞ্জামটি প্রোজেরিয়াতে নতুন এবং উদ্ভাবনী গবেষণা তৈরি করতে ব্যবহার করা হবে, সেইসাথে হৃদরোগ এবং বার্ধক্যের সাথে এর সম্পর্ক।  

3. হাচিনসন-গিলফোর্ড প্রোজেরিয়া সিন্ড্রোম ইনডিউসড-প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল (iPSCs) তৈরি করা

ইনডিউসড-প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল (আইপিএসসি) ফাইব্রোব্লাস্টে চারটি মানবিক ফ্যাক্টর, অক্ট 4, সোক্স 2, কেএলএফ 4 এবং সি-মাইকের ভিএসভিজি-সিউডোটাইপড রেট্রোভাইরাল ট্রান্সডাকশন ব্যবহার করে উদ্ভূত হয়েছিল। iPSC উপনিবেশগুলি মাউস-ভ্রূণীয় ফাইব্রোব্লাস্ট (MEFs) থেকে উদ্ভূত হয়েছিল। ব্যবহৃত পদ্ধতিটি মূলত পূর্বে বর্ণিত হিসাবে ছিল কিন্তু ইওএস রিপোর্টার ব্যবহার না করে (প্রকৃতি প্রোটোকল 4: 1828-1844, 2009)। 

4. মান নিয়ন্ত্রণ: বৈধতা এবং চরিত্রায়ন

বর্তমানে উপলব্ধ লাইনগুলি বেশ কয়েকটি বৈধকরণ পদক্ষেপের মধ্য দিয়ে গেছে (নিচে ডাউনলোডযোগ্য পিডিএফগুলি দেখুন):

5. আসল প্রারম্ভিক উপাদান যা থেকে এই আইপিএস কোষগুলি উদ্ভূত হয়েছিল৷

iPSC গুলি PRF সেল এবং টিস্যু ব্যাঙ্ক নন-ট্রান্সফর্মড ফাইব্রোব্লাস্ট সেল লাইন থেকে উদ্ভূত হয়েছিল।

সমস্ত আইপিএস লাইনের জন্য ব্যবহৃত ট্রান্সডাকশন পদ্ধতিটি ছিল রেট্রোভাইরাস এমকেওএস।

iPSC লাইন আইডি	মিউটেশন	লিঙ্গ এবং দানের বয়স	প্রারম্ভিক কোষের ধরন এখানে ক্লিক করুন.	সাপোর্টিং ডেটা
HGADFN003 iPS 1B	LMNAExon 11, 1824 সি>টি	পুরুষ 2 বছর 0 মাস	ডার্মাল ফাইব্রোব্লাস্ট HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA Exon 11, 1824 সি>টি	পুরুষ 2 বছর 0 মাস	ডার্মাল ফাইব্রোব্লাস্ট HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS 1D	LMNA Exon 11, 1824 সি>টি	পুরুষ 2 বছর 0 মাস	ডার্মাল ফাইব্রোব্লাস্ট HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA Exon 11, 1824 C>T	পুরুষ 8 বছর 5 মাস	ডার্মাল ফাইব্রোব্লাস্ট HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA Exon 11, 1824 C>T	পুরুষ 8 বছর 5 মাস	ডার্মাল ফাইব্রোব্লাস্ট HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	HGADFN167 এর মা (অপ্রভাবিত)	মহিলা 37 বছর 10 মাস	ডার্মাল ফাইব্রোব্লাস্ট HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	HGADFN167 এর মা (অপ্রভাবিত)	মহিলা 37 বছর 10 মাস	ডার্মাল ফাইব্রোব্লাস্ট HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	HGADFN167 এর পিতা (অপ্রভাবিত)	পুরুষ 40 বছর 5 মাস	ডার্মাল ফাইব্রোব্লাস্ট HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	HGADFN167 এর পিতা (অপ্রভাবিত)	পুরুষ 40 বছর 5 মাস	ডার্মাল ফাইব্রোব্লাস্ট HGFDFN168	168 iPS1P

6. ভবিষ্যতের iPSC আপডেট এবং নতুন সেল লাইনের জন্য আমাদের ইমেল তালিকায় যোগ দিন

আমরা iPSC লাইন তৈরি করা চালিয়ে যাচ্ছি। আপনি যদি পিআরএফ সেল এবং টিস্যু ব্যাঙ্কে থাকা iPSC-এর পর্যায়ক্রমিক আপডেট পেতে চান, তাহলে ক্লিক করে আমাদের ইমেল তালিকায় যোগ দিন এখানে

7. প্রশ্ন?

লেসলি গর্ডন, এমডি, পিএইচডি, মেডিকেল ডিরেক্টরের সাথে যেকোন প্রশ্ন বা প্রয়োজনে যোগাযোগ করুন lgordon@progeriaresearch.org অথবা 978-535-2594

8. আইপিএস সেল লাইন অর্ডার করা

2014 সালে, PRF আমাদের MTA-তে কোনো পরিবর্তন না করার নীতি চালু করেছে। এটি 14টি দেশের প্রতিষ্ঠানে 70 টি গবেষণা দলের সাথে 12 বছরের চুক্তিভিত্তিক ব্যবস্থার ফলাফল। PRF এবং এর পরামর্শদাতা সেই সময়ের মধ্যে উদ্ভূত সমস্যাগুলিকে বিবেচনায় নিয়েছে এবং সেই অনুযায়ী চুক্তি সম্পাদনা করেছে, যার ফলে আমরা যা ন্যায্য এবং যুক্তিসঙ্গত শর্ত মনে করি।

ইউএস ফেডারেল সরকারী প্রতিষ্ঠান বা প্রশ্নের জন্য, অনুগ্রহ করে ওয়েন্ডি নরিসের সাথে এখানে যোগাযোগ করুন: wnorris@brownhealth.org বা 401-274-1122 x 48063.

ধাপ 1: একটি আবেদন এবং উপাদান স্থানান্তর চুক্তি সম্পূর্ণ করুন

বেসরকারী প্রতিষ্ঠানের জন্য আবেদন এবং চুক্তি

বেসরকারী প্রতিষ্ঠানের জন্য উপাদান স্থানান্তর চুক্তি

ধাপ 2: সম্পূর্ণ আবেদন এবং উপাদান স্থানান্তর চুক্তি ওয়েন্ডি নরিসের কাছে ফেরত দিন wnorris@brownhealth.org. একবার অনুমোদিত হলে, আপনি আপনার অর্ডার এবং প্রত্যাশিত শিপিংয়ের তারিখ নিশ্চিত করে একটি ইমেল পাবেন। 

ধাপ 3: ডাঃ স্ট্যানফোর্ডের পরীক্ষাগার বর্তমানে হিমায়িত ক্রায়োভিয়ালগুলিতে লাইন বিতরণ করছে। শিপিং এবং ট্র্যাকিং তথ্য সহ সংস্কৃতি প্রেরণ করা হলে তার পরীক্ষাগার আপনাকে ইমেল করবে। অনভিজ্ঞ গবেষকদের মানব ভ্রূণের স্টেম সেল/iPSC-এর কাজের জন্য প্রয়োজনীয় বিশেষ কোর্সে প্রশিক্ষণ নেওয়ার নির্দেশ দেওয়া হয়েছে।

অটোয়া হসপিটাল রিসার্চ ইনস্টিটিউটের হিউম্যান প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল ফ্যাসিলিটি (ড. স্ট্যানফোর্ড দ্বারা পরিচালিত) প্রোজেরিয়া আইপিএসসি সেল লাইনের জন্য নির্দিষ্ট আইপিএসসি কালচার কৌশলগুলির মৌলিক বিষয়গুলির উপর ভার্চুয়াল একের পর এক প্রশিক্ষণ প্রদান করে। বিজ্ঞানীদের অভিজ্ঞতার স্তরের উপর নির্ভর করে প্রশিক্ষণের বিকল্প এবং বিন্যাস নমনীয়।  আরও তথ্যের জন্য, hpscf@ohri.ca ইমেল করুন.

ধাপ 4: অটোয়া বিশ্ববিদ্যালয় আপনাকে প্রতিটি iPSC লাইন এবং কুরিয়ার খরচের জন্য সরাসরি চালান পাঠাবে, যদি থাকে।

9. HGPS এবং নিয়ন্ত্রণ iPS সেল সংস্কৃতি মিডিয়া প্রস্তুতি

iPSC এবং ESC কে স্টেম সেল টেকনোলজিস (cat# 5825) থেকে mTeSR প্লাস খাওয়াতে হবে। সঞ্চয়স্থানের জন্য সরবরাহকারীর সুপারিশ অনুসরণ করুন.

10. ম্যাট্রিজেল প্লেট প্রস্তুত করা হচ্ছে

দ্রষ্টব্য: ম্যাট্রিজেল জড়িত সমস্ত পদক্ষেপ যত তাড়াতাড়ি সম্ভব সম্পন্ন করা উচিত এবং যতটা সম্ভব ঠান্ডা থাকা উচিত।

1. ম্যাট্রিজেল বোতল 4 এ গলান°C. প্রোটিনের ঘনত্ব খুঁজে পেতে সেই লটের বিশ্লেষণের শংসাপত্রটি পরীক্ষা করুন।
2. 5mg/mL এর চূড়ান্ত ঘনত্বে পৌঁছানোর জন্য গলানো ম্যাট্রিজেলে পর্যাপ্ত ঠান্ডা DMEM/F12 মিডিয়া যোগ করুন।
3. প্রি-চিল্ড 15mL ফ্যালকন টিউবে ধাপ 2 থেকে প্রস্তুত ম্যাট্রিজেলের 1mL অ্যালিকোট তৈরি করুন।
4. -20-এ সমস্ত অ্যালিকোট জমা এবং সংরক্ষণ করুন°গ.
5. ম্যাট্রিজেল প্লেট তৈরি করতে, -20 থেকে ম্যাট্রিজেল (1mL) এর একটি অ্যালিকোট সরান°C এবং 10mL ঠান্ডা DMEM/F12 যোগ করুন। পেলেট গলা না হওয়া পর্যন্ত ভালভাবে মেশান (বুদবুদ তৈরি না করে এবং সর্বদা দ্রবণ ঠান্ডা রাখুন)।
6. একটি 50mL টিউবে স্থানান্তর করুন, তারপর 20mL ঠান্ডা DMEM/F12 যোগ করুন (1mL ম্যাট্রিজেল অ্যালিকোট 30mL DMEM/F12-এ মিশ্রিত করা হয়), ভালভাবে মেশান৷
7. প্লেট (6টি ওয়েল প্লেটের জন্য 1mL/ওয়েল, 12টি ওয়েল প্লেটের জন্য 0.5mL/ওয়েল, 24টি ওয়েল প্লেটের জন্য 0.25mL/ওয়েল)। নিশ্চিত করুন যে দ্রবণটি প্লেটটিকে আলতো করে ঝাঁকিয়ে পুরো পৃষ্ঠের এলাকাকে ঢেকে দিচ্ছে। কোনো অবশিষ্ট ম্যাট্রিজেল পুনরায় হিমায়িত করবেন না।
8. প্লেটটি অবিলম্বে ব্যবহার করলে, প্লেটটিকে ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টা (বা 37 এ 30 মিনিট) বসতে দিন°গ), মাইক্রোস্কোপের নীচে ম্যাট্রিজেল পর্যবেক্ষণ করুন। ম্যাট্রিজেল ভালভাবে বিচ্ছুরিত হওয়া উচিত এবং "আঠালো" নয়।
9. অন্য সময়ে প্লেট ব্যবহার করলে, প্যারাফিল্ম দিয়ে প্লেটের প্রান্তটি মুড়ে 4 এ সংরক্ষণ করুন°সি 2 সপ্তাহ পর্যন্ত।

ম্যাট্রিজেল - বিডি/ফিশার, cat#CB-40230

DMEM/F12 – লাইফ টেকনোলজিস, cat#11330-057

ডাঃ উইলিয়াম স্ট্যানফোর্ড-2022

11. ES বা iPS কোষ গলানো (প্রতি ক্রায়ো-ভায়াল)

1. 4°C থেকে একটি ম্যাট্রিজেল প্লেট নিন এবং ঘরের তাপমাত্রায় এক ঘন্টার জন্য উষ্ণ করুন, অথবা একটি নতুন ম্যাট্রিজেল প্লেট তৈরি করুন (ম্যাট্রিজেল প্লেট প্রোটোকল প্রস্তুত করা দেখুন)।
2. 15mL ফ্যালকন টিউবে উষ্ণ 4mL mTeSR প্লাস।
3. তরল নাইট্রোজেন ট্যাঙ্ক থেকে কোষগুলি সরান এবং একটি 37 ডিগ্রি সেন্টিগ্রেড স্নানে ঘূর্ণায়মান করুন যতক্ষণ না শুধুমাত্র একটি ছোট বরফের খণ্ড বাকি থাকে। শিশি 1-2 মিনিটের মধ্যে গলাতে হবে। এই পদক্ষেপ দ্রুত সম্পন্ন করা আবশ্যক.
4. ইথানল সেল টিউব এবং ফ্যালকন মিডিয়া টিউব এবং ফণা মধ্যে স্থান.
5. 1mL ব্যবহার করুন ধীরে ধীরে চওড়া মুখের ডগা 4mL প্রাক-উষ্ণ মিডিয়াতে কোষ যোগ করুন (সেল সাসপেনশন মিশ্রিত করা এড়িয়ে চলুন)।
6. 5 মিনিটের জন্য 130 rcf এ স্পিন করুন।
7. সুপারনাট্যান্ট সরান।
8. PSC মিডিয়া 2mL যোগ করুন, এবং একটি প্রশস্ত মুখ টিপ সঙ্গে আলতো করে ক্লাম্পগুলি ভেঙে ফেলুন. একটি 6 ওয়েল প্লেটের একটি কূপে মিডিয়া স্থানান্তর করুন রক ইনহিবিটারের 2uL যোগ করুন (Y27632, 10uM এর চূড়ান্ত ঘনত্ব)। একটি ম্যাট্রিজেল প্রলিপ্ত কূপে প্লেট করুন (একটি 6টি ভাল প্লেটের)।
9. শিলা কোষগুলিকে আলতোভাবে কোষগুলিকে সমানভাবে বিতরণ করতে এবং একটি হাইপোক্সিক ইনকিউবেটরে রাখুন (5%O₂, 10% CO₂) বীজ বপনের পর 24 ঘন্টা প্লেটের ঝামেলা এড়িয়ে চলুন।

   দ্রষ্টব্য: ক্লম্পের অত্যধিক ভাঙ্গন বা আক্রমনাত্মক পাইপটিং এড়ানো খুবই গুরুত্বপূর্ণ। এটি উল্লেখযোগ্যভাবে বেঁচে থাকার হার কমাতে পারে। বীজ বপনের সময় কোষগুলি 100-300 কোষের বড় অংশে থাকা উচিত। মৃদু থাকার সময়, কোষগুলি গলানো হয়ে গেলে দ্রুত কাজ করার চেষ্টা করুন যাতে তারা ক্রাইওপ্রোটেক্ট্যান্টের সংস্পর্শে থাকে।

10. 24 ঘন্টা পরে মিডিয়া সরান এবং PSC মিডিয়ার 2mL যোগ করুন (একটি 6 কূপের জন্য, 12টি কূপের জন্য 1mL এবং 24টি কূপের জন্য 0.5mL)। hESC/iPSC প্রোটোকলের জন্য ফসল কাটা এবং পরিচর্যা দেখুন।

পিএসসি মিডিয়া

স্টেম সেল টেকনোলজিস (cat# 5825) থেকে mTeSR প্লাস। সঞ্চয়স্থানের জন্য সরবরাহকারীর সুপারিশ অনুসরণ করুন.

রক ইনহিবিটর Y27632 কি?

রক ইনহিবিটর Y27632 হল Rho সম্পর্কিত kinase p160 ROCK-এর একটি নির্বাচনী ইনহিবিটার। ROCK ইনহিবিটর Y27632 এর সাথে চিকিত্সা মানব ভ্রূণ স্টেম সেল (hESC) এবং মানব প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল (iPSC) এর বিচ্ছিন্নতা প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিস প্রতিরোধ করে, বেঁচে থাকার হার বৃদ্ধি করে এবং এইচইএসসি এবং হিপিএসসি-এর উপচাষ এবং গলানোর সময় প্লুরিপোটেন্সি বজায় রাখে। ROCK ইনহিবিটর Y27632 কে ক্রায়োপ্রিজারভেশনের সময় স্টেম সেলের বেঁচে থাকার হারকেও বাড়ানোর জন্য দেখানো হয়েছে। নোট করুন যে রক ইনহিবিটর অ্যালিকোটগুলি আলো এবং পুনরাবৃত্তিমূলক জমাট গলার চক্রের প্রতি সংবেদনশীল। সরবরাহকারীর প্রস্তাবিত শেলফ লাইফের মধ্যে এই অ্যালিকোটগুলি ব্যবহার করা নিশ্চিত করুন৷

ডাঃ উইলিয়াম স্ট্যানফোর্ড-2022

12. hESC/ iPSC-এর জন্য ফসল কাটা এবং পরিচর্যা করা

1. কোষগুলি গলানোর পরের দিন বেঁচে থাকার হার নির্ধারণ করতে মাইক্রোস্কোপের নীচে সেগুলি দেখুন। দ্রষ্টব্য: এটি একটি উচ্চ সংখ্যক অসংযুক্ত কোষ পর্যবেক্ষণ করা স্বাভাবিক। যতক্ষণ পর্যন্ত কিছু কোষ সংযুক্ত থাকে, 3-7 দিনের মধ্যে তাদের থেকে উপনিবেশ তৈরি হতে পারে।
2. কূপ থেকে মিডিয়া সরান এবং প্রতি কূপের তাজা ও উষ্ণ পিএসসি মিডিয়ার 2 মিলি (6 কূপের জন্য, 12টি কূপের জন্য 1 মিলি এবং 24টি কূপের প্লেটের জন্য 0.5 মিলি) পিপেট করুন। ইনকিউবেটরে প্লেট ফেরত দিন।
3. 60-70% সঙ্গম পর্যন্ত কোষগুলিকে খাওয়ানো হয় (সরবরাহকারীর সুপারিশ অনুসরণ করুন)।
4. দিন 2 থেকে, কোষগুলিকে পর্যবেক্ষণ করা উচিত এবং যে কোনও পৃথক কোষ যা বৃদ্ধি পাচ্ছে তা পরিষ্কার করা উচিত।
5. কোষগুলি পরিষ্কার করতে, পিকিং হুড ব্যবহার করুন এবং একটি পাইপেটের ডগা দিয়ে বিচ্ছিন্ন কোষগুলিকে স্ক্র্যাপ করুন।
6. একবার কক্ষগুলি পরিষ্কার হয়ে গেলে, উপরের ধাপগুলির মতো মিডিয়া পরিবর্তন করুন।

(হিমায়িত hESC/iPSC বা hESC/iPSC পাস করা দেখুন)

দ্রষ্টব্য:

পিএসসি মিডিয়া হাইপোক্সিক পরিবেশে আরও দক্ষ হতে দৃঢ়প্রতিজ্ঞ ছিল। আমরা আরও লক্ষ্য করেছি যে কম পার্থক্য ঘটে যখন কোষগুলি হাইপোক্সিক ইনকিউবেটর বনাম নরমোক্সিকে বৃদ্ধি পায়। অবশেষে, হাইপোক্সিক ইনকিউবেটর ব্যবহার করার সময় বীজযুক্ত কোষগুলির বেঁচে থাকার হার আরও ভাল থাকে।

নরমোক্সিক: 37°C, 21% O₂, 5% CO₂

হাইপোক্সিক: 37°সি, 5%O₂, 10% CO₂

ডাঃ উইলিয়াম স্ট্যানফোর্ড-2022

13. এইচইএসসি/আইপিএসসি পাস

1. একটি 6 ভাল ম্যাট্রিজেল প্রলিপ্ত প্লেটে 2mL PSC মিডিয়া যোগ করুন এবং একপাশে রাখুন।
2. প্লেটটি পাস করার জন্য নিন এবং কূপ থেকে মিডিয়াটি সরিয়ে ফেলুন এবং একবার 1 মিলি পিবিএস(-/-) দিয়ে ধুয়ে ফেলুন।
3. কূপে 1mL EDTA দ্রবণ যোগ করুন এবং ঘরের তাপমাত্রায় 3-4 মিনিট রেখে দিন। প্লেটটি চারপাশে সরান না কারণ কোষগুলি বিচ্ছিন্ন হওয়া শুরু করতে পারে।
4. EDTA সমাধান সরান এবং PSC মিডিয়ার 1mL যোগ করুন। EDTA কোষে 4 মিনিটের বেশি রেখে দেবেন না কারণ এর ফলে কোষগুলি উঠে যাবে।
5. একটি সেল স্ক্র্যাপার ব্যবহার করে কোষগুলিকে স্ক্র্যাপ করুন এবং PSC মিডিয়া ধারণকারী আপনার প্লেটের 6 টি কূপের মধ্যে কোষগুলিকে ভাগ করুন। উপনিবেশ টুকরা অত্যধিক ভাঙ্গন এড়িয়ে চলুন, এবং স্ক্র্যাপিং সঙ্গে মৃদু হতে চেষ্টা করুন. কোষগুলিকে বড় অংশে রাখার চেষ্টা করুন। প্রয়োজনে ক্লাম্পগুলি ভাঙতে একটি প্রশস্ত মুখের পিপেটের টিপ ব্যবহার করুন। কোষের অত্যধিক ভাঙ্গনের ফলে কোষের মৃত্যু বা অতিবাহিত হওয়ার পর অতিরিক্ত স্বতঃস্ফূর্ত পার্থক্য হতে পারে।
6. 37 এ ইনকিউবেট করুন°C প্রতিটি কূপে সমানভাবে কোষ বিতরণ করার পর (8 চিত্র বা এল আকৃতির ঝাঁকুনি)। 24 ঘন্টার জন্য প্লেট ঝামেলা এড়িয়ে চলুন পরে পাসিং.

উল্লেখ্য: একবার কোষগুলি স্ক্র্যাপ করা হয়ে গেলে আপনি যত তাড়াতাড়ি সম্ভব সেগুলিকে নতুন প্লেটে স্থানান্তর করতে চান কারণ কোষগুলি দ্রুত পুনরায় সংযুক্ত হবে (5 মিনিটের মধ্যে)।

যদি EDTA কোষে 4 মিনিটের বেশি সময় ধরে রেখে দেওয়া হয়, কোষগুলি বিচ্ছিন্ন হতে শুরু করতে পারে। যদি এটি ঘটে থাকে, 4mL PSC মিডিয়া সহ একটি 15mL ফ্যালকনে কোষগুলি সংগ্রহ করুন। 5 মিনিটের জন্য 130 rcf এ সেল স্পিন করুন। 1mL মিডিয়া দিয়ে পেলেটটিকে আবার সাসপেন্ড করুন এবং 6টি ওয়েল ম্যাট্রিজেল প্রলিপ্ত প্লেটের মধ্যে সমানভাবে ভাগ করুন (কূপ প্রতি 160uL)।

EDTA সমাধান: 0.5M EDTA (pH 8.0) এর 500uL DPBS (-/-) এর 500mL এ যোগ করুন। 0.9 গ্রাম NaCl যোগ করুন। দ্রবণটিকে জীবাণুমুক্ত করার জন্য ফিল্টার করুন এবং 6 মাস পর্যন্ত 4°C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করুন।

কাগজ থেকে:

রাসায়নিকভাবে সংজ্ঞায়িত সংস্কৃতির অবস্থার মধ্যে এনজাইম-মুক্ত বিচ্ছেদ দ্বারা মানব প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেলগুলির উত্তরণ এবং উপনিবেশের বিস্তার

জিনেট বিয়ার,¹ ড্যানিয়েল আর গুলব্রানসন,^2,3 নিকোল জর্জ,⁴লরেন আই. সিনিসকালচি,¹ জেফরি জোন্স,^4,5 জেমস এ. থমসন,^2,3,6 এবং গুওকাই চেন^1,2

14. হিমায়িত hESC/iPSC

1. বায়ো-কুল (নিয়ন্ত্রিত রেট ফ্রিজার) চালু করুন এবং তাপমাত্রা -7 ডিগ্রি সেলসিয়াসে সামঞ্জস্য করুন।
2. ইনকিউবেটর থেকে কোষগুলি সরান এবং অণুবীক্ষণ যন্ত্রের নীচে সঙ্গম এবং রূপবিদ্যা পর্যবেক্ষণ করুন।
3. যদি কূপগুলি 70% সঙ্গমযুক্ত হয়, পুরানো মিডিয়া সরিয়ে ফেলুন এবং PBS(-/-) দিয়ে একবার ধুয়ে ফেলুন তারপর প্রতি কূপে 1 মিলি ইডিটিএ দ্রবণ যোগ করুন (ইডিটিএ দ্রবণের সাথে পাসিং দেখুন)।
4. ঘরের তাপমাত্রায় 3-4 মিনিটের জন্য সেঁকুন।
5. EDTA সমাধানটি অ্যাসপিরেট করুন এবং 1 মিলি কোল্ড mFreSR মিডিয়া যোগ করুন (cat#05855, স্টেম সেল টেকনোলজিস)।
6. কোষগুলিকে আলতো করে তুলতে একটি সেল স্ক্র্যাপার ব্যবহার করুন। যতটা সম্ভব বড় খণ্ডে কোষ রাখুন এবং উপরে এবং নীচে পাইপ করা এড়িয়ে চলুন।
7. একটি প্রশস্ত মুখের ডগা ব্যবহার করে একটি ক্রায়োটিউবে কোষ/mFreSR স্থানান্তর করুন। ধাপ 8 এর জন্য প্রস্তুত না হওয়া পর্যন্ত বরফের উপর শিশি রাখুন।
8. টিউবগুলিকে বায়ো-কুলে রাখুন এবং 10 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন।
9. তরল নাইট্রোজেন পান।
10. 10 মিনিটের পরে, তরল নাইট্রোজেনে একটি স্প্যাটুলা ডুবিয়ে এবং প্রায় 10-30 সেকেন্ডের জন্য ক্রাইও-ভায়ালের পাশে স্পর্শ করে বা যতক্ষণ না আপনি ক্রাইও-ভায়ালের পাশে একটি স্ফটিক আকার দেখতে পাচ্ছেন ততক্ষণ পর্যন্ত কোষগুলি বীজ করুন।
11. "PROG" বোতাম টিপে প্রোগ্রাম 1 শুরু করুন এবং আবার বোতাম টিপে প্রোগ্রামের মধ্য দিয়ে যান এবং আপনি 0.5°C/মিনিট হার দেখতে পাবেন। , তারপর "RUN" টিপুন।
12. একবার তাপমাত্রা -65 ডিগ্রি সেলসিয়াসে পৌঁছালে ক্রাইও-টিউবগুলি স্থানান্তরিত এবং তরল নাইট্রোজেনে সংরক্ষণ করা যেতে পারে।

বিকল্প

আরেকটি বিকল্প হল ক্রায়ো-টিউবগুলিকে একটি হিমায়িত পাত্রে (বায়োসিশন-কুলসেল) রাখা এবং রাতারাতি -80 ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা। পরের দিন ক্রাইও-টিউবগুলিকে তরল নাইট্রোজেনে (তরল বা বাষ্প পর্যায়ে) নিয়ে যান।

ডাঃ উইলিয়াম স্ট্যানফোর্ড-2022