Trypsin

Trypsin EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)

Hanks ausgewogene Salzlösung

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) Calciumchlorid, (-)Magnesiumchlorid, (-) Magnesiumsulfat)

DMSO zum Einfrieren

DMSO in Zellkulturqualität

Die Zellen werden gefroren auf Trockeneis in einer Konzentration von ca. 5 x 10 geliefert.⁵Zellen/Fläschchen

Protokoll zum Auftauen von Fibroblasten

1. Tauen Sie die Zellen schnell in einem 37 °C heißen Wasserbad auf.
2. Wischen Sie die Außenseite des Fläschchens mit 70% Ethanol ab.
3. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in eine T25-Flasche mit 5 ml Wachstumsmedium ohne Puromycin.
4. Stellen Sie den Kolben über Nacht in einen Inkubator mit 37 °C.
5. Beobachten Sie am nächsten Tag unter dem Mikroskop, ob sich Zellen angeheftet haben.
6. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch frisches Wachstumsmedium.

Subkultivierung von PRF-Zelllinien

1) Wenn sich Zellen etabliert haben und wachsen, beginnen Sie, Medien mit 0,75 μg/ml Puromycin zu verwenden. Bewahren Sie die Zellen weiterhin in Medien mit 0,75 μg/ml Puromycin auf.

2) Zellen sollten geteilt werden, wenn sie konfluent sind.

3) So teilen Sie Zellen (die angegebenen Volumina gehen davon aus, dass sich die Zellen in einem T25 befinden):

A. Entfernen Sie das Medium unter Verwendung steriler Techniken und spülen Sie den Kolben mit 2–3 ml sterilem HBSS. Entfernen und entsorgen Sie HBSS.

B. 1 ml Trypsin hinzufügen und 2-3 Minuten inkubieren. Die Zellen sollten unter einem invertierten Mikroskop überprüft werden, um festzustellen, ob sie begonnen haben, sich zu runden, anzuheben und zu schweben. Wenn sich die Zellen nach 3 Minuten nicht ablösen, können Sie weitere 1-2 Minuten inkubieren.

C. Den Deckel festziehen und den Kolben vorsichtig von einer Seite zur anderen kippen, um alle Zellen zu lösen. Bei Bedarf kann der Kolben leicht auf die Seite geklopft werden, um die Zellen zu lösen.

D. Geben Sie 4 ml neues Medium in den Kolben, sobald die Zellen schwimmen, um das Trypsin zu inaktivieren. Spülen Sie die Seiten des Kolbens mehrere Male mit dem neuen Medium ab, um alle Zellen vom Kunststoff zu waschen und in die Lösung zu geben. Entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit, die Zellen enthält, und geben Sie sie in einen 15-ml-Erlenmeyerkolben (oder 50 ml, wenn Sie 3 oder mehr Kolben zusammenlegen).

E. Unter Verwendung steriler Techniken entnehmen Sie eine Aliquote zur Zählung auf einem Hämozytometer.

F. Während Sie die Zellen zählen, sollte der Rest der Lösung 5 Minuten lang bei 1000 U/min in der klinischen Zentrifuge geschleudert werden.

4) Nach der Berechnung der Zellzahl werden die Zellen in einer Größe von 2,5 x 10⁵ Zellen pro T 25 Filterflasche.

5) Die Zellen sollten alle 2–3 Tage mit frischem Wachstumsmedium gefüttert werden, das 0,75 μg/ml Puromycin enthält.

Einfrieren:

Zellen sollten bei mindestens 5x 10 eingefroren werden⁵ Zellen /ml/Kryovial in Wachstumsmedien enthält 10% DMSO und 30% FBS ohne Puromycin und anschließend über Nacht in eine Isopropanol-Gefrierkammer bei -80°C gestellt. Am nächsten Tag in flüssigen Stickstoff überführen.

Wendy Norris