1. iPSC Hintergrundinformationen für Laien

Stammzellen sind „unreife“ Zellen, die sich noch nicht zu einem bestimmten Zelltyp entwickelt haben. Sie sind anpassungsfähig, da sie das Potenzial haben, sich zu vielen verschiedenen Arten reifer Zellen im Körper zu entwickeln, wie etwa zu Zellen, aus denen das Herz oder die Blutgefäße sowie andere Gewebe und Organe bestehen. 2007 entdeckten Forscher eine Strategie zur Erzeugung von Stammzellen im Labor durch die Umprogrammierung reifer adulter Zellen, die wir üblicherweise zu Forschungszwecken züchten.^{1, 2} . Diese künstlich erzeugten Stammzellen werden induzierte pluripotente Stammzellen („iPSCs“) genannt. Für das Gebiet der Progerie ist dies ein großer Durchbruch. Zum ersten Mal können Wissenschaftler jetzt Progerie-Stammzellen erzeugen und Fragen dazu stellen, wie Stammzellen bei Progerie funktionieren und sich entwickeln. Bisher gab es keine Quelle für menschliche Progerie-Stammzellen und daher fehlten Informationen darüber, wie Progerie-Stammzellen im Vergleich zu Stammzellen von Menschen ohne Progerie funktionieren. Darüber hinaus können Wissenschaftler die Progerie-Stammzellen neu programmieren, um zum ersten Mal reife Progerie-Blutgefäße, Herzzellen und andere Zelltypen zu erzeugen. Bis jetzt gab es keine Quelle für menschliche Progerie-Herz- oder Blutgefäßzellen.  Wir können nun Schlüsselfragen stellen Fragen zu der Herzkrankheit, die bei Progerie-Patienten zu einem frühen Tod durch Herzinfarkte und Schlaganfälle führt. Wir können diese Entdeckungen mit den Herzkrankheiten und dem Altern in der Allgemeinbevölkerung vergleichen und mehr darüber erfahren, was das Altern bei uns allen beeinflusst. Es wurden bereits mehrere hervorragende Studien mit Progerie-Stammzellen veröffentlicht.^3-5  Unser Ziel bei der Progeria Research Foundation ist es, mithilfe dieses unschätzbaren Werkzeugs viele weitere Entdeckungen zu ermöglichen. Eine Einführung in Stammzellen finden Sie auf dieser Website der US-Regierung: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Zweck der Erzeugung und Verteilung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSC) durch die Progeria Research Foundation

Die Mission der Progeria Research Foundation besteht darin, Behandlungsmöglichkeiten und Heilmittel für das Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom und seine altersbedingten Erkrankungen zu finden. 2009 begann die PRF eine Zusammenarbeit mit einem Expertenteam von Wissenschaftlern an der Universität Toronto, Kanada, unter der Leitung von Dr. William Stanford, um qualitativ hochwertige Progeria-iPSCs zu erzeugen. Dr. Stanford ist der kanadische Forschungslehrstuhlinhaber für integrative Stammzellbiologie. Seit 2011 arbeitet die PRF weiterhin mit Dr. Stanford an der Universität Ottawa, Kanada, zusammen, wo er Professor für Zell- und Molekularmedizin an der medizinischen Fakultät und leitender Wissenschaftler am Sprott Centre for Stem Cell Research des Ottawa Hospital Research Institute ist.

Unser Ziel ist es, Forschern auf der ganzen Welt dieses unschätzbar wertvolle Werkzeug zur Verfügung zu stellen. Dieses neue Forschungsinstrument wird verwendet, um neue und innovative Forschungen zum Thema Progerie sowie zu deren Zusammenhang mit Herzerkrankungen und Alterung voranzutreiben.  

3. Erzeugung von Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom-induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) wurden durch VSVG-pseudotypisierte retrovirale Transduktion von vier menschlichen Faktoren, Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc, in Fibroblasten gewonnen. iPSC-Kolonien wurden aus Maus-Embryonalfibroblasten (MEFs) gewonnen. Das verwendete Verfahren war im Wesentlichen wie zuvor beschrieben, jedoch ohne Verwendung des EOS-Reporters (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Qualitätskontrolle: Validierung und Charakterisierung

Die derzeit verfügbaren Linien wurden mehreren Validierungsschritten unterzogen (siehe herunterladbare PDFs unten):

5. Ursprüngliches Ausgangsmaterial, aus dem diese iPS-Zellen gewonnen wurden

iPSCs wurden aus nicht-transformierten Fibroblastenzelllinien der PRF Cell & Tissue Bank gewonnen.

Die für alle iPS-Linien verwendete Transduktionsmethode war Retrovirus MKOS.

iPSC-Leitungs-ID	Mutation	Geschlecht und Spendealter	Ursprünglicher Zelltyp klicken Sie hier.	Unterstützende Daten
HGADFN003 iPS 1B	LMNAExon 11, 1824 C>T	Männlich, 2 Jahre, 0 Monate	Dermale Fibroblasten HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA Exon 11, 1824 C>T	Männlich, 2 Jahre, 0 Monate	Dermale Fibroblasten HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS 1D	LMNA Exon 11, 1824 C>T	Männlich, 2 Jahre, 0 Monate	Dermale Fibroblasten HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA Exon 11, 1824 C>T	Männlich, 8 Jahre, 5 Monate	Dermale Fibroblasten HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA Exon 11, 1824 C>T	Männlich, 8 Jahre, 5 Monate	Dermale Fibroblasten HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	Mutter von HGADFN167 (nicht betroffen)	Weiblich, 37 Jahre, 10 Monate	Dermale Fibroblasten HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	Mutter von HGADFN167 (nicht betroffen)	Weiblich, 37 Jahre, 10 Monate	Dermale Fibroblasten HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	Vater von HGADFN167 (nicht betroffen)	Männlich, 40 Jahre 5 Monate	Dermale Fibroblasten HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	Vater von HGADFN167 (nicht betroffen)	Männlich, 40 Jahre 5 Monate	Dermale Fibroblasten HGFDFN168	168 iPS1P

6. Abonnieren Sie unsere E-Mail-Liste für zukünftige iPSC-Updates und neue Zelllinien

Wir generieren weiterhin iPSC-Linien. Wenn Sie regelmäßige Updates zu den in der PRF Cell & Tissue Bank aufbewahrten iPSCs erhalten möchten, abonnieren Sie bitte unsere E-Mail-Liste, indem Sie auf klicken Hier

7. Fragen?

Bei Fragen oder Wünschen wenden Sie sich bitte an Leslie Gordon, MD, PhD, Medizinischer Direktor, unter lgordon@progeriaresearch.org oder 988-535-2594

8. Bestellung von iPS-Zelllinien

Im Jahr 2014 hat PRF eine Richtlinie eingeführt, die keine Änderungen an unserem MTA vorsieht. Dies ist das Ergebnis von 12 Jahren vertraglicher Vereinbarungen mit 70 Forschungsteams, die an Institutionen in 14 Ländern arbeiten. PRF und sein Rechtsberater haben die in diesem Zeitraum aufgetretenen Probleme berücksichtigt und die Vereinbarung entsprechend überarbeitet, was zu Bedingungen geführt hat, die wir für fair und angemessen halten.

Bei Fragen zu US-Bundesbehörden wenden Sie sich bitte an Wendy Norris unter: wnorris@brownhealth.org oder 401-274-1122 x 48063.

Schritt 1: Ausfüllen eines Antrags und einer Materialtransfervereinbarung

Antrag und Vereinbarung für nichtstaatliche Institutionen

Materialtransfervereinbarung für nichtstaatliche Institutionen

Schritt 2: Senden Sie den ausgefüllten Antrag und die Materialtransfervereinbarung an Wendy Norris unter wnorris@brownhealth.org. Nach der Genehmigung erhalten Sie eine E-Mail mit der Bestätigung Ihrer Bestellung und dem voraussichtlichen Versanddatum. 

Schritt 3: Dr. Stanfords Labor verteilt derzeit Linien in gefrorenen Kryoröhrchen. Sein Labor wird Ihnen eine E-Mail mit Versand- und Trackinginformationen senden, sobald die Kultur versandt wurde. Unerfahrene Forscher werden angewiesen, sich an Spezialkursen zu schulen, die für die Arbeit mit menschlichen embryonalen Stammzellen/iPSCs unerlässlich sind.

Die Human Pluripotent Stem Cell Facility (unter der Leitung von Dr. Stanford) am Ottawa Hospital Research Institute bietet virtuelle Einzelschulungen zu den Grundlagen von iPSC-Kulturtechniken speziell für Progeria iPSC-Zelllinien an. Schulungsoptionen und -format sind je nach Erfahrungsniveau der Wissenschaftler flexibel.  Für weitere Informationen senden Sie bitte eine E-Mail an hpscf@ohri.ca.

Schritt 4: Die Universität Ottawa stellt Ihnen jede iPSC-Leitung zuzüglich eventueller Kurierkosten direkt in Rechnung.

9. HGPS und Control iPS Zellkulturmedien Vorbereitung

iPSCs und ESCs müssen mit mTeSR Plus von Stem Cell Technologies (cat# 5825) gefüttert werden. Bitte beachten Sie die Lagerungsempfehlungen des Lieferanten.

10. Vorbereiten von Matrigelplatten

Notiz: Alle Schritte mit Matrigel sollten so schnell wie möglich und so kalt wie möglich durchgeführt werden.

1. Matrigelflasche bei 4 °C auftauen°C. Überprüfen Sie das Analysezertifikat dieser Charge, um die Proteinkonzentration zu ermitteln.
2. Fügen Sie dem aufgetauten Matrigel ausreichend kaltes DMEM/F12-Medium hinzu, um eine Endkonzentration von 5 mg/ml zu erreichen.
3. Machen Sie 1-ml-Aliquots des vorbereiteten Matrigels aus Schritt 2 in vorgekühlten 15-ml-Falcon-Röhrchen.
4. Alle Aliquots einfrieren und bei -20 lagern.°C.
5. Um Matrigelplatten herzustellen, entnehmen Sie ein Aliquot Matrigel (1ml) aus -20°C und 10 ml kaltes DMEM/F12 hinzufügen. Gut mischen, bis das Pellet auftaut (ohne Blasenbildung und die Lösung immer kalt halten).
6. In ein 50-ml-Röhrchen überführen, dann 20 ml kaltes DMEM/F12 hinzufügen (1 ml Matrigel-Aliquot wird in 30 ml DMEM/F12 verdünnt) und gut mischen.
7. Platte (1 ml/Vertiefung für 6-Well-Platte, 0,5 ml/Vertiefung für 12-Well-Platte, 0,25 ml/Vertiefung für 24-Well-Platte). Stellen Sie durch leichtes Schütteln der Platte sicher, dass die Lösung die gesamte Oberfläche bedeckt. Restliches Matrigel nicht erneut einfrieren.
8. Wenn Sie die Platte sofort verwenden, lassen Sie sie 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen (oder 30 Minuten bei 37°C) Matrigel unter dem Mikroskop beobachten. Matrigel sollte gut verteilt und nicht „klumpig“ sein.
9. Wenn Sie die Platten zu einem anderen Zeitpunkt verwenden, wickeln Sie den Rand der Platte mit Parafilm ein und lagern Sie sie bei 4°C für bis zu 2 Wochen.

Matrigel – BD/Fisher, cat#CB-40230

DMEM/F12 – Life Technologies, cat#11330-057

Dr. William Stanford-2022

11. Auftauen von ES- oder iPS-Zellen (pro Kryo-Fläschchen)

1. Nehmen Sie eine Matrigelplatte aus 4 °C und erwärmen Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder stellen Sie eine neue Matrigelplatte her (siehe Protokoll zur Herstellung der Matrigelplatte).
2. Erwärmen Sie 4 ml mTeSR Plus in einem 15 ml-Falcon-Röhrchen.
3. Nehmen Sie die Zellen aus dem Flüssigstickstofftank und schwenken Sie sie in einem 37 °C heißen Bad, bis nur noch ein kleiner Eisklumpen übrig ist. Das Fläschchen sollte in 1–2 Minuten auftauen. Dieser Schritt muss schnell durchgeführt werden.
4. Ethanol-Zellenröhrchen und Falcon-Medienröhrchen in die Haube stellen.
5. Verwenden Sie 1 ml breite Mundspitze, um langsam Zellen zu 4 ml vorgewärmtem Medium hinzufügen (Vermeiden Sie das Mischen der Zellsuspension).
6. 5 Minuten bei 130 rcf zentrifugieren.
7. Überstand entfernen.
8. Fügen Sie 2 ml PSC-Medium hinzu und verwenden Sie eine Weithalsspitze Klumpen schonend auflösen. Übertragen Sie das Medium in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und fügen Sie 2 µl ROCK-Inhibitor (Y27632, Endkonzentration 10 µM) hinzu. Plazieren Sie es in eine mit Matrigel beschichtete Vertiefung (einer 6-Well-Platte).
9. Schütteln Sie die Zellen vorsichtig, um sie gleichmäßig zu verteilen, und legen Sie sie in einen hypoxischen Inkubator (5%O₂, 10% CO₂). Vermeiden Sie 24 Stunden nach der Aussaat eine Störung der Platte.

   NOTIZ: Es ist sehr wichtig, ein übermäßiges Aufbrechen der Klumpen oder aggressives Pipettieren zu vermeiden. Dies kann die Überlebensrate erheblich verringern. Die Zellen sollten zum Zeitpunkt der Aussaat in Klumpen von 100-300 Zellen verbleiben. Gehen Sie behutsam vor, versuchen Sie aber schnell zu arbeiten, sobald die Zellen aufgetaut sind, um die Zeit, in der sie mit dem Kryoprotektivum in Kontakt sind, zu minimieren.​

10. Entfernen Sie das Medium nach 24 Stunden und fügen Sie 2 ml PSC-Medium hinzu (für eine 6-Well-Platte, 1 ml für eine 12-Well-Platte und 0,5 ml für eine 24-Well-Platte). Siehe Protokoll „Ernte und Pflege für hESC/iPSC“.

PSC-Medien

mTeSR Plus von Stem Cell Technologies (cat# 5825). Bitte beachten Sie die Lagerungsempfehlungen des Lieferanten.

Was ist der ROCK-Inhibitor Y27632?

Der ROCK-Inhibitor Y27632 ist ein selektiver Inhibitor der Rho-assoziierten Kinase p160 ROCK. Die Behandlung mit dem ROCK-Inhibitor Y27632 verhindert die durch Dissoziation induzierte Apoptose menschlicher embryonaler Stammzellen (hESC) und menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSC), erhöht die Überlebensrate und erhält die Pluripotenz während der Subkultivierung und des Auftauens von hESCs und hiPSCs. Der ROCK-Inhibitor Y27632 hat sich auch als wirksam erwiesen, um die Überlebensrate von Stammzellen während der Kryokonservierung zu erhöhen. Beachten Sie, dass Rock-Inhibitor-Aliquots lichtempfindlich und auf wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen reagieren. Verwenden Sie diese Aliquots unbedingt innerhalb der vom Lieferanten empfohlenen Haltbarkeitsdauer.

Dr. William Stanford-2022

12. Gewinnung und Pflege von hESC/iPSC

1. Am Tag nach dem Auftauen können Sie die Zellen unter dem Mikroskop untersuchen, um die Überlebensrate zu bestimmen. HINWEIS: Es ist normal, eine hohe Anzahl nicht anhaftender Zellen zu beobachten. Solange einige Zellen anhaften, können innerhalb von 3 bis 7 Tagen Kolonien daraus entstehen.
2. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und pipettieren Sie 2 ml (für eine Platte mit 6 Vertiefungen, 1 ml für eine Platte mit 12 Vertiefungen und 0,5 ml für eine Platte mit 24 Vertiefungen) frisches und warmes PSC-Medium pro Vertiefung. Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
3. Die Zellen werden gefüttert, bis 60-70% konfluent ist (befolgen Sie die Empfehlungen des Lieferanten).
4. Ab dem zweiten Tag sollten die Zellen beobachtet und von eventuell wachsenden differenzierten Zellen gereinigt werden.
5. Um Zellen zu reinigen, verwenden Sie die Picking Hood und kratzen Sie differenzierte Zellen mit einer Pipettenspitze ab.
6. Sobald die Zellen gereinigt sind, wechseln Sie das Medium wie in den obigen Schritten beschrieben.

(Siehe Einfrieren von hESC/iPSC oder Passieren von hESC/iPSC)

NOTIZ:

Es wurde festgestellt, dass PSC-Medien in einer hypoxischen Umgebung effizienter sind. Wir haben auch beobachtet, dass weniger Differenzierung auftritt, wenn Zellen in hypoxischen Inkubatoren gezüchtet werden als in normoxischen. Schließlich haben ausgesäte Zellen eine bessere Überlebensrate, wenn ein hypoxischer Inkubator verwendet wird.

Normoxisch: 37°C, 21% O₂, 5% CO₂

Hypoxisch: 37°C, 5%O₂, 10% CO₂

Dr. William Stanford-2022

13. Bestehen der hESC/iPSC

1. Geben Sie 2 ml PSC-Medium in eine mit Matrigel beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen und legen Sie diese beiseite.
2. Nehmen Sie die zu passagierende Platte, entfernen Sie das Medium aus der Vertiefung und waschen Sie es einmal mit 1 ml PBS (-/-).
3. Geben Sie 1 ml der EDTA-Lösung in die Vertiefung und lassen Sie sie 3–4 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Bewegen Sie die Platte nicht, da sich sonst Zellen ablösen können.
4. Entfernen Sie die EDTA-Lösung und fügen Sie 1 ml PSC-Medium hinzu. Lassen Sie das EDTA nicht länger als 4 Minuten auf den Zellen, da sich die Zellen sonst ablösen.
5. Kratzen Sie die Zellen mit einem Zellschaber ab und verteilen Sie sie auf die 6 Vertiefungen Ihrer Platte mit PSC-Medium. Vermeiden Sie übermäßiges Aufbrechen der Koloniestücke und versuchen Sie, beim Kratzen behutsam vorzugehen. Versuchen Sie, die Zellen in großen Stücken zu halten. Verwenden Sie bei Bedarf eine Pipettenspitze mit breiter Öffnung, um Klumpen aufzubrechen. Übermäßiges Aufbrechen der Zellen kann zum Zelltod oder übermäßiger spontaner Differenzierung nach der Passage führen.
6. Inkubieren bei 37°C nach gleichmäßiger Verteilung der Zellen in jeder Vertiefung (8- oder L-förmiges Schütteln). Plattenstörungen 24 Stunden nach der Passage vermeiden.

NOTIZ: Sobald die Zellen abgekratzt wurden, sollten Sie sie so schnell wie möglich auf die neue Platte übertragen, da sich die Zellen schnell wieder anheften (innerhalb von 5 Minuten).

Wenn EDTA länger als 4 Minuten auf den Zellen verbleibt, können sich die Zellen ablösen. Wenn dies geschieht, sammeln Sie die Zellen einfach in einem 15-ml-Falcon mit 4 ml PSC-Medium. Zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 130 rcf. Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 ml Medium und verteilen Sie es gleichmäßig auf einer mit Matrigel beschichteten Platte mit 6 Vertiefungen (160 µl pro Vertiefung).

EDTA-Lösung: Geben Sie 500 µl 0,5 M EDTA (pH 8,0) in 500 ml DPBS (-/-). Fügen Sie 0,9 g NaCl hinzu. Filtern Sie die Lösung zum Sterilisieren und lagern Sie sie bis zu 6 Monate bei 4 °C.

Aus dem Papier:

Passagierung und Kolonieexpansion humaner pluripotenter Stammzellen durch enzymfreie Dissoziation unter chemisch definierten Kulturbedingungen

Jeanette Beers,¹ Daniel R. Gulbranson,^2,3 Nicole George,⁴Lauren I. Siniscalchi,¹ Jeffrey Jones,^4,5 James A. Thomson,^2,3,6 Und Guokai Chen^1,2

14. Einfrieren von hES-/iPS-Zellen

1. Schalten Sie Bio-Cool (Controlled Rate Freezer) ein und stellen Sie die Temperatur auf -7 °C ein.
2. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und beobachten Sie Konfluenz und Morphologie unter dem Mikroskop.
3. Wenn die Vertiefungen 70%-konfluent sind, entfernen Sie das alte Medium und waschen Sie einmal mit PBS (-/-). Geben Sie dann 1 ml EDTA-Lösung (siehe Durchgang mit EDTA-Lösung) pro Vertiefung hinzu.
4. 3–4 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Saugen Sie die EDTA-Lösung ab und geben Sie 1 ml kaltes mFreSR-Medium (cat#05855, Stem Cell Technologies) hinzu.
6. Heben Sie die Zellen vorsichtig mit einem Zellschaber an. Halten Sie die Zellen möglichst in großen Stücken und vermeiden Sie Auf- und Abpipettieren.
7. Übertragen Sie die Zellen/mFreSR mithilfe einer Weithalsspitze in ein Kryoröhrchen. Bewahren Sie die Fläschchen auf Eis auf, bis Sie für Schritt 8 bereit sind.
8. Stellen Sie die Röhrchen in Bio-Cool und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang.
9. Besorgen Sie sich flüssigen Stickstoff.
10. Nach 10 Minuten säen Sie die Zellen aus, indem Sie einen Spatel in flüssigen Stickstoff tauchen und die Seite des Kryoröhrchens etwa 10 bis 30 Sekunden lang berühren oder bis Sie sehen, dass sich an der Seite des Kryoröhrchens eine Kristallform bildet.
11. Starten Sie Programm 1 durch Drücken der Taste „PROG“ und gehen Sie das Programm durch, indem Sie die Taste erneut drücken. Sie sollten die Rate von 0,5 °C/min sehen. Drücken Sie dann „RUN“.
12. Sobald die Temperatur -65 °C erreicht, können die Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff umgefüllt und darin gelagert werden.

Alternativen

Alternativ können die Kryoröhrchen auch in einen Gefrierbehälter (Biocision-CoolCell) gegeben und über Nacht bei -80°C gelagert werden. Am nächsten Tag können die Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff (flüssig oder gasförmig) überführt werden.

Dr. William Stanford-2022