Vom Versand gefrorener Zellen

Gefrorene Zellen werden in 1-ml-Aliquots auf Trockeneis geliefert. Bewahren Sie die Zellen gefroren auf, bis sie für die Zellkultur aufgetaut werden, oder legen Sie sie in flüssigen Stickstoff, wenn Sie nicht sofort mit der Kultur beginnen. Es wird jedoch empfohlen, dass Sie, wenn Sie die Zellen für eine spätere Verwendung aufbewahren möchten, frische Vorräte anbauen und mehrere Ampullen einfrieren. Die Zellen werden in 45% RPMI-1640, 50% fötalem Kälberserum und 5% DMSO (Gewebekulturqualität) kryokonserviert.

1. Geben Sie 10 ml RPMI-1640, 15% fötales Kälberserum (FCS), ±Antibiotika in eine T-25-Flasche.
2. Lassen Sie das Medium 30 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 5% CO2 in Luft ausgleichen.
3. Tauen Sie jede Ampulle mit gefrorenen Zellen einzeln in einem 37 °C warmen Wasserbad oder einem Becher mit lauwarmem Wasser auf.
4. Reinigen Sie die Außenseite der Ampulle schnell mit einem sterilen Isopropanol-Vorbereitungspad, wickeln Sie das Vorbereitungspad anschließend zum Schutz der Finger um die Ampulle und brechen Sie das Siegel der Ampulle unter einer biologischen Sicherheitshaube auf.
5. Entnehmen Sie den 1 ml gefrorener Zellen mit einer sterilen Pasteurpipette aus Glas und geben Sie ihn in einen T-25-Kolben mit 10 ml Medium. Beschriften Sie den Kolben deutlich, um jede Zelllinie zu identifizieren.
6. Legen Sie die Zellen in einen befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 51 TP3T CO2 in der Luft.
7. Nach 24 Stunden 5 ml Medium von oben entfernen, ohne die am Boden des Kolbens abgelagerten Lymphozyten zu stören, und durch 5 ml vorgewärmtes Medium ersetzen.
8. Versorgen Sie die Zellen alle 3 – 4 Tage mit 5 – 6 ml frischem Medium und teilen Sie sie bei Bedarf in neue Kulturen auf.

Vom Versand lebender Kulturen

1. Lebende Lymphozytenkulturen werden in T-25-Flaschen geliefert, die bis zum Rand mit RPMI-1640, 15% FCS und 1% Penicillin-Streptomycin (Gibco) gefüllt sind. Die Deckel sind fest verschlossen und mit Parafilm versiegelt.
2. Parafilm entfernen.
3. Platzieren Sie die Kulturen in einem befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 5% CO2 in der Luft und lassen Sie die Zellen sich absetzen (20 – 30 Minuten).
4. Mit einer sterilen Pipette das gesamte Medium bis auf 10 – 15 ml entfernen und entsorgen.
5. Setzen Sie die Deckel wieder auf die Flaschen, lockern Sie sie leicht, um einen Gasaustausch zu ermöglichen (stellen Sie sicher, dass sich kein Medium auf den Deckelgewinden befindet. Wenn das der Fall ist, sollten Sie die Kulturen in eine neue Flasche umfüllen.) Legen Sie die Kulturen wieder in den Inkubator mit 5% CO2 in Luft. Sie sollten sich in ein oder zwei Tagen erholen.
6. Füttern Sie die Zellen alle 3 – 4 Tage mit frischem Medium, indem Sie die Zellaggregate resuspendieren, 50 -60 % des Volumens entfernen und durch frisches Medium ersetzen. Aus dem Kolben entfernte Zellen können bei Bedarf zum Anlegen neuer Kulturen verwendet werden.

Wendy Norris