Tripsina

Tripsina EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)

Solución salina equilibrada de Hank

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) cloruro de calcio, (-) cloruro de magnesio, (-) sulfato de magnesio)

DMSO para congelar

DMSO de grado de cultivo celular

Las células llegarán congeladas en hielo seco a una concentración de aproximadamente 5 x 10⁵células/vial

Protocolo para descongelar fibroblastos

1. Descongele las células rápidamente en un baño de agua a 37 °C.
2. Limpie el exterior del vial con etanol 70%.
3. Transfiera las células descongeladas a un matraz T25 que contenga 5 ml de medio de crecimiento sin puromicina.
4. Coloque el matraz en una incubadora a 37 °C durante la noche.
5. Al día siguiente, observe bajo el microscopio para asegurarse de que las células se hayan adherido.
6. Retire el medio y reemplácelo con medio de crecimiento nuevo.

Subcultivo de líneas celulares PRF

1) Cuando las células se hayan establecido y estén creciendo, comience a utilizar medios que contengan 0,75 μg/ml de puromicina. Continúe manteniendo las células en medios que contengan 0,75 μg/ml de puromicina.

2) Las células deben dividirse cuando confluyen.

3) Para dividir las células (los volúmenes dados suponen que las células están en un T25):

A. Utilizando una técnica estéril, retire el medio y enjuague el matraz con 2-3 ml de HBSS estéril. Retire y deseche el HBSS.

B. Agregue 1 ml de tripsina e incube durante 2 a 3 minutos. Las células deben examinarse con un microscopio invertido para determinar si han comenzado a redondearse, levantarse y flotar. Si las células no se desprenden después de 3 minutos, puede incubarlas durante 1 o 2 minutos más.

C. Apriete la tapa e incline suavemente el matraz de un lado al otro para desalojar todas las células. Si es necesario, puede golpear ligeramente el matraz en un costado para aflojar las células.

D. Añada 4 ml de medio nuevo al matraz tan pronto como las células floten para inactivar la tripsina. Enjuague los lados del matraz varias veces con el medio nuevo para lavar todas las células del plástico y colocarlas en la solución. Retire todo el líquido que contenga células y transfiéralo a un matraz cónico de 15 ml (o 50 ml si está juntando 3 o más matraces).

E. Utilizando una técnica estéril, extraiga una alícuota para realizar el recuento en un hemocitómetro.

F. Mientras se cuentan las células, el resto de la solución debe centrifugarse en la centrífuga clínica durante 5 minutos a 1000 rpm.

4) Después de calcular el recuento de células, coloque las células en placas a una proporción de 2,5 x 10⁵ células por matraz filtrante T 25.

5) Las células deben alimentarse cada 2-3 días con medio de crecimiento fresco que contenga 0,75 μg/ml de puromicina.

Congelación:

Las células deben congelarse a no menos de 5x 10⁵ células/ml/criovial en medios de crecimiento que contiene 10% DMSO y 30% FBS Sin puromicina y posteriormente se coloca en una cámara de congelación con isopropanol a -80°C durante la noche. Se transfiere al nitrógeno líquido al día siguiente.

Wendy Norris