Trypsine

Trypsine EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)

Solution saline équilibrée de Hank

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) chlorure de calcium, (-) chlorure de magnésium, (-) sulfate de magnésium)

DMSO pour la congélation

DMSO de qualité pour culture cellulaire

Les cellules arriveront congelées sur de la glace sèche à une concentration d'environ 5 x 10⁵cellules/flacon

Protocole de décongélation des fibroblastes

1. Décongeler rapidement les cellules dans un bain-marie à 37°C.
2. Essuyez l’extérieur du flacon avec de l’éthanol 70%.
3. Transférer les cellules décongelées dans un flacon T25 contenant 5 ml de milieu de croissance sans puromycine.
4. Placer le flacon dans un incubateur à 37°C pendant la nuit.
5. Le lendemain, observez au microscope pour vous assurer que les cellules se sont attachées.
6. Retirez le support et remplacez-le par un nouveau support de croissance.

Sous-culture de lignées cellulaires PRF

1) Une fois les cellules établies et en croissance, commencer à utiliser un milieu contenant 0,75 μg/ml de puromycine. Continuer à maintenir les cellules dans un milieu contenant 0,75 μg/ml de puromycine.

2) Les cellules doivent être divisées lorsqu'elles sont confluentes.

3) Pour diviser les cellules (les volumes indiqués supposent que les cellules sont dans un T25) :

A. À l'aide d'une technique stérile, retirez le milieu et rincez le flacon avec 2 à 3 ml de HBSS stérile. Retirez et jetez le HBSS.

B. Ajoutez 1 ml de trypsine et laissez incuber pendant 2 à 3 minutes. Les cellules doivent être examinées au microscope inversé pour déterminer si elles ont commencé à se redresser, à se soulever et à flotter. Si les cellules ne se détachent pas après 3 minutes, vous pouvez incuber encore 1 à 2 minutes

C. Serrez le bouchon et inclinez doucement le flacon d'un côté à l'autre pour déloger toutes les cellules. Le flacon peut être légèrement tapoté sur le côté pour détacher les cellules si nécessaire.

D. Ajoutez 4 ml de nouveau milieu au flacon dès que les cellules flottent pour inactiver la trypsine. Rincez les parois du flacon plusieurs fois avec le nouveau milieu pour éliminer toutes les cellules du plastique et les placer dans la solution. Retirez tout le liquide contenant des cellules et transférez-le dans un récipient conique de 15 ml (ou de 50 ml si vous regroupez 3 flacons ou plus).

E. À l’aide d’une technique stérile, prélevez une aliquote pour la compter sur un hématimètre.

F. Pendant que vous comptez les cellules, le reste de la solution doit être centrifugé dans la centrifugeuse clinique pendant 5 minutes à 1 000 tr/min.

4) Après avoir calculé votre nombre de cellules, placez les cellules sur une plaque à 2,5 x 10⁵ cellules par flacon filtrant T 25.

5) Les cellules doivent être nourries tous les 2 à 3 jours avec un milieu de croissance frais contenant 0,75 μg/ml de puromycine.

Gel:

Les cellules doivent être congelées à au moins 5 x 10⁵ cellules /ml/cryovial dans les milieux de croissance contenant 10% DMSO et 30% FBS sans puromycine et ensuite placé dans une chambre de congélation à l'isopropanol à -80°C pendant la nuit. Transférer dans l'azote liquide le lendemain.

Wendy Norris