De l'expédition de cellules congelées

Les cellules congelées seront reçues en aliquotes de 1 ml sur de la glace sèche. Conservez les cellules congelées jusqu'à leur décongélation pour la culture cellulaire ou placez-les dans un récipient à azote liquide si vous ne démarrez pas les cultures immédiatement. Cependant, si vous souhaitez stocker les cellules pour une utilisation ultérieure, il est recommandé de faire pousser de nouveaux stocks et de congeler plusieurs ampoules. Les cellules sont cryoconservées dans du RPMI-1640 45%, du sérum de veau fœtal 50% et du DMSO 5% (qualité culture tissulaire).

1. Placer 10 ml de RPMI-1640, 15% sérum de veau fœtal (FCS), ± antibiotiques dans un flacon T-25.
2. Laisser le milieu s'équilibrer dans un incubateur humidifié à 37°C avec 5% CO2 dans l'air pendant 30 minutes.
3. Décongelez chaque ampoule de cellules congelées dans un bain-marie à 37°C ou dans un bécher d’eau tiède, une à la fois.
4. Nettoyez rapidement l’extérieur de l’ampoule avec un tampon de préparation stérile à base d’isopropanol, puis enroulez le tampon de préparation autour de l’ampoule pour protéger les doigts et briser le joint de l’ampoule à l’intérieur d’une hotte de sécurité biologique.
5. Prélever 1 ml de cellules congelées à l'aide d'une pipette Pasteur en verre stérile et les placer dans un flacon T-25 contenant 10 ml de milieu. Étiqueter clairement le flacon pour identifier chaque lignée cellulaire.
6. Placer les cellules dans un incubateur humidifié à 37°C avec 5% CO2 dans l'air.
7. Après 24 heures, prélever 5 ml de milieu par le haut sans perturber les lymphocytes déposés au fond du flacon et les remplacer par 5 ml de milieu préchauffé.
8. Nourrissez les cellules avec 5 à 6 ml de milieu frais tous les 3 à 4 jours et divisez-les en nouvelles cultures si nécessaire.

De l'expédition de cultures vivantes

1. Les cultures de lymphocytes vivants seront reçues dans des flacons T-25 remplis jusqu'au bord avec du RPMI-1640, du 15% FCS, du 1% Penicillin-Streptomycin (Gibco). Les bouchons seront bien serrés et scellés avec du parafilm.
2. Retirer le parafilm.
3. Placer les cultures dans un incubateur humidifié à 37°C avec 5% CO2 dans l'air et laisser les cellules se déposer (20 à 30 minutes).
4. À l’aide d’une pipette stérile, retirez tout le milieu sauf 10 à 15 ml et jetez-le.
5. Remettez les bouchons sur les flacons légèrement desserrés pour permettre l'échange de gaz (vérifiez que les filetages des bouchons ne sont pas recouverts de milieu. Si c'est le cas, vous pouvez transférer les cultures dans un nouveau flacon.) Remettez les cultures dans l'incubateur avec 5% CO2 dans l'air. Elles devraient récupérer en un jour ou deux.
6. Nourrissez les cellules avec du milieu frais tous les 3 à 4 jours en remettant en suspension les agrégats cellulaires et en retirant 50 à 60% du volume et en les remplaçant par du milieu frais. Les cellules retirées du flacon peuvent être utilisées pour initier de nouvelles cultures si nécessaire.

Wendy Norris