Protocole de culture des lymphoblastes

Milieu de croissance

RPMI 1640 – ThermoFisher # 11875
15% Sérum fœtal bovin (FBS) – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) Pénicilline-Streptomycine (en option) – ThermoFisher #15140-122

Notes générales

• Le milieu de croissance doit toujours être équilibré dans l'incubateur à 37°C, 5% CO₂ pendant 30 minutes avant utilisation
• Utilisez toujours des flacons avec des bouchons ventilés
• Toujours incuber le flacon en position verticale
• Il ne faut pas utiliser plus de 20 ml dans un flacon T25

Décongélation des cellules congelées

Les cellules congelées seront reçues en aliquotes de 1 ml sur de la glace sèche. Conservez les cellules congelées jusqu'à leur décongélation pour la culture cellulaire ou placez-les dans un récipient à azote liquide si vous ne démarrez pas les cultures immédiatement. Cependant, si vous souhaitez stocker les cellules pour une utilisation ultérieure, il est recommandé de faire pousser de nouveaux stocks et de congeler plusieurs ampoules. Les cellules sont cryoconservées dans du RPMI-1640 45%, du FBS 50% et du DMSO 5% (qualité culture tissulaire).

1. 1. Placer 10 ml de sérum fœtal bovin (FBS) RPMI-1640, 15%, ± antibiotiques dans un flacon T-25 avec un bouchon ventilé.
   2. Laisser le milieu s'équilibrer dans un incubateur humidifié à 37°C avec du CO 5%₂ à l'air libre pendant 30 minutes. Les flacons doivent être incubés en position verticale.
   3. Décongelez chaque ampoule ou flacon de cellules congelées dans un bain-marie à 37 °C ou dans un bécher d'eau tiède, une à la fois.
   4. Nettoyez rapidement l'extérieur de l'ampoule ou du flacon avec de l'éthanol 70%. Si les cellules sont dans une ampoule en verre, cassez soigneusement l'ampoule en prenant soin de protéger vos doigts des éclats de verre.
   5. Prélever 1 ml de cellules congelées à l'aide d'une pipette stérile et les placer dans un flacon T-25 contenant 10 ml de milieu. Étiqueter clairement le flacon pour identifier chaque lignée cellulaire.
   6. Placer le flacon dans un incubateur humidifié à 37°C avec du CO 5%₂ dans l'air. Les flacons doivent être incubés en position verticale.
   7. Après 24 heures, prélever 5 ml de milieu par le haut sans perturber les lymphocytes déposés au fond du flacon et remplacer par 5 ml de milieu préchauffé.
   8. Procéder au protocole de culture de cellules lymphoblastiques.

Culture de lymphoblastes

1. 1. Trois à quatre jours après décongélation, compter les cellules. Les cellules ne sont pas adhérentes et se développent en amas. Briser les amas en pipetant doucement.
   2. Compter les cellules.
   3. Idéalement, la concentration cellulaire ne devrait pas dépasser 2 x 10⁶ cellules/ml.
   4. En fonction de la concentration cellulaire, réalimenter, diviser ou congeler les cellules.
   5. Nourrir en ajoutant 5 à 6 ml de milieu de croissance équilibré.
   6. Semer les nouvelles cultures à au moins 2 x 10⁵ cellules/ml.
   7. Les cellules doivent être congelées à environ 5 x 10⁶ cellules/ml. Suivre le protocole de congélation des cellules.

Congélation des lymphoblastes

1. 1. Les cellules doivent être congelées à environ 5 x 10⁶ cellules/ml.
   2. Transférer le volume approprié de cellules dans un tube conique de 15 ou 50 ml.
   3. Centrifuger à 4°C à 100 xg pendant 10 minutes.
   4. Retirer le milieu et le remettre en suspension dans un volume approprié de milieu de congélation froid.
   5. Transférer 1 ml de cellules chacune dans un cryotube.
   6. Placer les cryotubes dans la chambre de congélation et placer la chambre au congélateur à -80 °C pendant la nuit.
   7. Transférer les cryotubes dans l’azote liquide le lendemain.

Wendy Norris