תא מונצח

פרוטוקולי תרבות

פרוטוקול תרבות תאים מונצחים

אנו מודים לד"ר מרטין דורף מאוניברסיטת הרווארד על היצירה והאספקה של קווי התאים המונצחים לבנק התאים והרקמות של PRF. תודה לך.

קווי תאים PRF הונצחו באמצעות הפרוטוקול הבא:

זיהום רטרוווירוס

א. ייצור וירוס: 12-24 שעות לפני ההעברה, תאי HEK293 אריזות צופו על צלחת 100 מ"מ במפגש 60-80%. כל צלחת הועברה יחד עם 12 מיקרוגרם מבנה רטרו-ויראלי pBABE-puro (SV40T) ו-12 מיקרוגרם pCL-Ampho Retrovirus Packaging Vector. מצע התרבות נשאב 8-10 שעות לאחר ההעברה, והוחלף ב-10 מ"ל של מדיום שלם. התרבית הודגרה למשך 48-72 שעות נוספות כדי להשיג טיטר ויראלי אופטימלי.

ב. הדבקת תאי מטרה: תאי המטרה צופו על צלחת 100 מ"מ 12-18 שעות לפני ההדבקה. המדיום מתאי האריזה נאסף וסונן דרך מסנן אצטט תאית או פוליסולפוני בגודל 0.45 מיקרון. לאחר שהתאים היו 40-60% מתלכדים, נוספה 8 מ"ל מדיום המכיל וירוסים עם ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל פוליברן. שלושה סבבי זיהום בוצעו ברצף, בערך 12 שעות זה מזה. המדיום הוחלף לאחר דגירה של 24 שעות.

ג. בחירת קווי תאים יציבים: 72 שעות לאחר ההדבקה, התאים עברו טריפסין, פוצלו ב-1:3 והועברו לשתי צלחות של 100 מ"מ בנוכחות 3 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין, בתוספת צלחת ביקורת אחת ללא אנטיביוטיקה. מצע התרבות הוחלף כל יומיים או שלושה במשך כשבועיים עד 4 שבועות כדי לייצר שורות תאים יציבות.

אמצעי צמיחה

DMEM- Invitrogen #11960-044 (גלוקוז גבוה ללא L-גלוטמין)

15% FBS סרום בקר עוברי

1% (1x) פניצילין-סטרפטומיצין (Invitrogen#15140-122)

1% (1X) L-גלוטמין (Invitrogen#25030-081)

0.75 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין (InvivoGen #ant-pr-1)

טריפסין

טריפסין EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)

תמיסת המלח המאוזנת של האנק

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) סידן כלוריד, (-) מגנזיום כלוריד, (-) מגנזיום גופרתי)

DMSO להקפאה

דרגת תרבות תא DMSO

תאים יגיעו קפואים על קרח יבש בריכוז של כ-5 על 10⁵תאים/בקבוקון

פרוטוקול להפשרת פיברובלסטים

הפשרה מהירה של תאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
נגב את החלק החיצוני של הבקבוקון עם אתנול 70%.
העבירו את התאים המופשרים לבקבוק T25 המכיל 5 מ"ל של אמצעי גידול ללא פורומיצין.
מניחים את הבקבוק באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
למחרת, התבוננו מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים מחוברים.
הסר את המדיה והחלף בחומר גידול טרי.

תת-תרבות שורות תאים PRF

1) כאשר תאים מבוססים וגדלים, התחל להשתמש במדיה המכילה 0.75 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין. המשך לשמור על התאים במדיה המכילה 0.75 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין.

2) יש לפצל תאים כאשר הם מתכנסים.

3) כדי לפצל תאים (הנפחים הניתנים בהנחה שהתאים נמצאים ב-T25):

א. באמצעות טכניקה סטרילית, הסר את המדיה ושטוף את הבקבוק ב-2-3 מ"ל של HBSS סטרילי. הסר והסר את HBSS.

ב. הוסף 1 מ"ל טריפסין ודגירה במשך 2-3 דקות. יש לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לקבוע אם הם החלו להתעגל למעלה, להתרומם ולצוף. אם התאים אינם מנותקים לאחר 3 דקות, ניתן לדגור עוד 1-2 דקות

ג. הדקו את המכסה והטיפו בעדינות את הבקבוק מצד לצד כדי לעקור את כל התאים. ניתן להקיש קלות על הבקבוק על הצד כדי לשחרר את התאים במידת הצורך.

ד הוסף 4 מ"ל של מדיה חדשה לבקבוק ברגע שהתאים צפים כדי להשבית את הטריפסין. שטפו את הצדדים של הבקבוק כמה פעמים עם המדיה החדשה כדי לשטוף את כל התאים מהפלסטיק ולהיכנס לתמיסה. הסר את כל התאים המכילים נוזלים והעבר לקוני של 15 מ"ל (או 50 מ"ל אם אתה מאחד 3 צלוחיות או יותר).

ה.באמצעות טכניקה סטרילית, הסר מנה לספירה על המציטומטר.

ו. בזמן שאתה סופר תאים, יש לסובב את שאר התמיסה בצנטריפוגה הקלינית למשך 5 דקות ב-1000 סל"ד.

4) לאחר חישוב ספירת התאים, צלחו תאים ב-2.5 על 10⁵ תאים לכל בקבוק עליון מסנן T 25.

5) יש להאכיל תאים כל 2-3 ימים במצע גידול טרי המכיל 0.75 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין.

קְפִיאָה:

יש להקפיא את התאים בגודל של לא פחות מ-5x10⁵ תאים /ml/cryovial במדיות צמיחה המכיל 10% DMSO ו-30% FBS ללא פורומיצין ולאחר מכן הונח בתא הקפאה של איזופרופנול ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מעבירים לחנקן הנוזלי למחרת.

למידע נוסף אנא צור קשר:

לסלי ב. גורדון, MD, PhD

פרופסור לחקר רפואת ילדים וורן אלפרט בית הספר לרפואה של אוניברסיטת בראון ומחלקה לרפואת ילדים, בית החולים לילדים הסברו, פרובידנס, מחלקת הרדמה RI, בית החולים לילדים בוסטון ובית הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון, מנהל רפואי MA, קרן המחקר פרוג'ריה

טלפון: 978-535-2594
פקס: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

וונדי נוריס

PRF תא ורקמות בנק
טלפון: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org

הירשם

עבור שלנו

עדכונים!

הירשם עכשיו

ביחד, אנחנו

רָצוֹן

למצוא את התרופה!

תרום עכשיו