פרוטוקול לטיפוח לימפובלסטים

בינוני צמיחה

RPMI 1640 – ThermoFisher # 11875
15% סרום בקר עוברי (FBS) – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) פניצילין-סטרפטומיצין (אופציונלי) – ThermoFisher #15140-122

הערות כלליות

• תמיד יש לאזן את מצע הצמיחה באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 30 דקות לפני השימוש
• השתמש תמיד בצלוחיות עם מכסים מאווררים
• תמיד יש לדגור את הבקבוק במצב זקוף
• אין להשתמש ביותר מ-20 מ"ל בבקבוק T25

הפשרת תאים קפואים

תאים קפואים יתקבלו במנות של 1 מ"ל על קרח יבש. שמור תאים קפואים עד להפשרה עבור תרבית תאים או מקום באחסון חנקן נוזלי אם לא מתחילים תרביות מיד. עם זאת, מומלץ שאם אתה מתכוון לאחסן את התאים לשימוש מאוחר יותר, לגדל מלאי טרי ולהקפיא אמפולות מרובות. התאים נשמרים בהקפאה ב-45% RPMI-1640, 50% FBS ו-5% DMSO (דרגת תרבית רקמה).

1. 1. מניחים 10 מ"ל של RPMI-1640, 15% סרום בקר עוברי (FBS), ± אנטיביוטיקה בבקבוק T-25 עם מכסה מאוורר.
   2. אפשר לתקשורת להתאזן באינקובטור לחות של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ באוויר למשך 30 דקות. יש להדגיר צלוחיות במצב זקוף.
   3. הפשר כל אמפולה או בקבוקון של תאים קפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס או בכוס מים פושרים, אחד בכל פעם.
   4. נקה במהירות את החלק החיצוני של האמפולה או הבקבוקון עם אתנול 70%. אם התאים נמצאים באמפולה מזכוכית, שברו בזהירות את האמפולה תוך הקפדה על הגנה על האצבעות מפני זכוכית שבורה.
   5. הסר את 1 מ"ל של תאים קפואים עם פיפטה סטרילית והנח בבקבוק T-25 עם 10 מ"ל של מדיום. תווית ברורה לבקבוק כדי לזהות כל שורת תאים.
   6. הנח את הבקבוק באינקובטור לחות של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ באוויר. יש להדגיר צלוחיות במצב זקוף.
   7. לאחר 24 שעות, הסר 5 מ"ל של מדיום מלמעלה מבלי להפריע לימפוציטים שהתיישבו בתחתית הבקבוק והחליפו ב-5 מ"ל של מדיום שחומם מראש.
   8. המשך עם פרוטוקול תרבית תאים לימפובלסטים.

תרבות לימפובלסטים

1. 1. שלושה עד ארבעה ימים לאחר ההפשרה, ספור תאים. תאים אינם נצמדים וגדלים בגושים. לפרק גושים על ידי פיפטינג עדין.
   2. ספירת תאים.
   3. באופן אידיאלי, ריכוז התא לא יעלה על 2x10⁶ תאים/מ"ל.
   4. בהתאם לריכוז התא, הזן מחדש, פיצול או הקפאת תאים.
   5. הזינו מחדש על ידי הוספת 5-6 מ"ל של מצע גידול מאוזן.
   6. זרעו תרבויות חדשות בגודל של לא פחות מ-2 על 10⁵ תאים/מ"ל.
   7. יש להקפיא את התאים בגודל של כ-5 על 10⁶ תאים/מ"ל. עקוב אחר פרוטוקול הקפאת תאים.

לימפובלסטים מקפיאים

1. 1. יש להקפיא את התאים בגודל של כ-5 על 10⁶ תאים/מ"ל.
   2. העבר נפח מתאים של תאים לצינור חרוטי של 15 או 50 מ"ל.
   3. צנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס ב-100 xg למשך 10 דקות.
   4. הסר את המדיום והשהה מחדש בנפח מתאים של מדיום הקפאה קר.
   5. העברת 1 מ"ל תאים כל אחד לתוך cryovial.
   6. מניחים cryovials בתא הקפאה ומניחים את החדר במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   7. העבירו את ה-cryovials לחנקן נוזלי למחרת.

וונדי נוריס