पीआरएफ सेल लाइनों को पिघलाना

1. कोशिकाओं को 37˚C जल स्नान में तेजी से पिघलाएं।
2. शीशी के बाहरी भाग को 70% इथेनॉल से पोंछें।
3. पिघली हुई कोशिकाओं को 5 मिली वृद्धि माध्यम वाले T25 फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
4. फ्लास्क को 37˚C इनक्यूबेटर में रात भर रखें।
5. अगले दिन, माइक्रोस्कोप से निरीक्षण करके सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं जुड़ गई हैं।
6. मीडिया को हटा दें और उसके स्थान पर ताजा वृद्धि मीडिया लगाएं।

पीआरएफ कोशिका लाइनों का उपसंवर्धन

1. कोशिकाओं को संलयित होने पर विभाजित किया जाना चाहिए।
2. कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए (दी गई मात्रा यह मानकर ली गई है कि कोशिकाएँ T25 में हैं):
   a) स्टेराइल तकनीक का उपयोग करते हुए, मीडिया को हटाएँ और फ्लास्क को 2-3 मिली स्टेराइल HBSS से धोएँ। HBSS को हटाएँ और फेंक दें।
   बी) 1 मिली ट्रिप्सिन डालें और 2-3 मिनट तक इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को उल्टे माइक्रोस्कोप से जांचना चाहिए ताकि पता चल सके कि वे गोल, ऊपर और तैरने लगी हैं या नहीं। अगर 3 मिनट के बाद भी कोशिकाएं अलग नहीं होती हैं, तो आप 1-2 मिनट और इनक्यूबेट कर सकते हैं।
   सी) ढक्कन को कस लें और सभी कोशिकाओं को हटाने के लिए फ्लास्क को धीरे से एक तरफ से दूसरी तरफ झुकाएं। यदि आवश्यक हो तो कोशिकाओं को ढीला करने के लिए फ्लास्क को हल्के से साइड से थपथपाया जा सकता है।
   d) ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए जैसे ही कोशिकाएँ तैरने लगें, फ्लास्क में 4 मिली लीटर नया माध्यम डालें। प्लास्टिक से सभी कोशिकाओं को धोने और घोल में मिलाने के लिए फ्लास्क के किनारों को नए माध्यम से कई बार धोएँ। सभी तरल युक्त कोशिकाओं को निकालें और 15 मिली लीटर के शंक्वाकार (या 50 मिली लीटर यदि आप 3 या अधिक फ्लास्क जमा कर रहे हैं) में स्थानांतरित करें।
   ई) स्टेराइल तकनीक का उपयोग करते हुए, हेमोसाइटोमीटर पर गिनती के लिए एक अंश निकालें।
   च) जब आप कोशिकाओं की गिनती कर रहे हों, तो शेष विलयन को क्लिनिकल सेंट्रीफ्यूज में 1000 आरपीएम पर 5 मिनट तक घुमाना चाहिए।
3. अपनी कोशिका गणना की गणना करने के बाद, कोशिकाओं को 2.5 x 10 पर प्लेट करें⁵ प्रति T25 फिल्टर शीर्ष कुप्पी में कोशिकाएं।
4. कोशिकाओं को हर 2-3 दिन में ताजा वृद्धि माध्यम दिया जाना चाहिए।

बर्फ जमना:

कोशिकाओं को 5 x 10 से कम तापमान पर जमाया नहीं जाना चाहिए⁵ 10% DMSO और 30% FBS युक्त ग्रोथ मीडिया में कोशिकाओं/एमएल/क्रायोविअल को रखा गया और बाद में -80˚C पर एक आइसोप्रोपेनॉल फ्रीजिंग चैंबर में रात भर रखा गया। अगले दिन तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।

फाइब्रोब्लास्ट्स को उपसंस्कृत करने और फ्रीज करने के लिए प्रोटोकॉल