अमर कोशिका

संस्कृति प्रोटोकॉल

अमर कोशिका संवर्धन प्रोटोकॉल

हम हार्वर्ड विश्वविद्यालय के डॉ. मार्टिन डॉर्फ को पीआरएफ सेल और टिशू बैंक को अमर कोशिका रेखाएँ प्रदान करने और उदारतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए धन्यवाद देते हैं। धन्यवाद।

पीआरएफ सेल लाइनों को निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके अमर किया गया:

रेट्रोवायरस संक्रमण

ए. वायरस उत्पन्न करना: ट्रांसफ़ेक्शन से 12-24 घंटे पहले, पैकेजिंग HEK293 कोशिकाओं को 60-80% संगम पर 100-मिमी प्लेट पर चढ़ाया गया था। प्रत्येक प्लेट को 12μg रेट्रोवायरल कंस्ट्रक्ट pBABE-puro (SV40T) और 12μg pCL-Ampho रेट्रोवायरस पैकेजिंग वेक्टर के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। ट्रांसफ़ेक्शन के 8-10 घंटे बाद कल्चर मीडियम को एस्पिरेट किया गया और 10ml पूरे मीडियम से बदल दिया गया। इष्टतम वायरल टिटर प्राप्त करने के लिए कल्चर को अतिरिक्त 48-72 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया।

बी. लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित करना: संक्रमण से 12-18 घंटे पहले लक्ष्य कोशिकाओं को 100 मिमी की प्लेट पर चढ़ाया गया था। पैकेजिंग कोशिकाओं से माध्यम एकत्र किया गया और 0.45-μm सेल्यूलोज एसीटेट या पॉलीसल्फोनिक फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया। एक बार जब कोशिकाएँ 40-60% संलयित हो गईं, तो 10 μg/ml पॉलीब्रीन की अंतिम सांद्रता के साथ 8 मिली वायरस युक्त माध्यम मिलाया गया। संक्रमण के तीन दौर क्रमिक रूप से, ~12 घंटे के अंतराल पर किए गए। 24 घंटे के ऊष्मायन के बाद माध्यम को बदल दिया गया।

सी. स्थिर सेल लाइनों का चयन: संक्रमण के 72 घंटे बाद, कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज़ किया गया, 1:3 अनुपात में विभाजित किया गया और 3 μg/ml प्यूरोमाइसिन की मौजूदगी में दो 100 मिमी प्लेटों में स्थानांतरित किया गया, साथ ही एंटीबायोटिक के बिना एक नियंत्रण प्लेट भी। स्थिर कोशिका रेखाएँ बनाने के लिए लगभग 2 से 4 सप्ताह तक हर 2 या 3 दिन में कल्चर माध्यम बदला गया।

ग्रोथ मीडिया

DMEM- इंविट्रोजन #11960-044 (एल-ग्लूटामाइन के बिना उच्च ग्लूकोज)

15% FBS फीटल बोवाइन सीरम

1% (1x) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (इंविट्रोजन#15140-122)

1% (1X) एल-ग्लूटामाइन (इंविट्रोजन#25030-081)

0.75 μg/ml प्यूरोमाइसिन (इनविवोजेन 1TP5टैंट-पीआर-1)

ट्रिप्सिन

ट्रिप्सिन EDTA सी .25% (इंविट्रोजन#25200-056)

हैंक का संतुलित नमक समाधान

HBSS- (इंविट्रोजन#14170 (1X) (-) कैल्शियम क्लोराइड, (-) मैग्नीशियम क्लोराइड, (-) मैग्नीशियम सल्फेट)

ठंड के लिए डीएमएसओ

सेल कल्चर ग्रेड डीएमएसओ

कोशिकाएं लगभग 5 x 10 की सांद्रता पर सूखी बर्फ पर जमी हुई आएंगी⁵कोशिकाएँ/शीशी

फाइब्रोब्लास्ट को पिघलाने का प्रोटोकॉल

कोशिकाओं को 37°C जल में तेजी से पिघलाएं।
शीशी के बाहरी भाग को 70% इथेनॉल से पोंछें।
पिघली हुई कोशिकाओं को प्यूरोमाइसिन रहित 5 मिली वृद्धि माध्यम युक्त T25 फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
फ्लास्क को 37°C इनक्यूबेटर में रात भर रखें।
अगले दिन, माइक्रोस्कोप से निरीक्षण करके सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं जुड़ गई हैं।
मीडिया को हटा दें और उसके स्थान पर ताजा वृद्धि मीडिया लगाएं।

पीआरएफ कोशिका लाइनों का उपसंवर्धन

1) जब कोशिकाएँ स्थापित हो जाती हैं और बढ़ती हैं, तो 0.75 μg/ml प्यूरोमाइसिन युक्त माध्यम का उपयोग करना शुरू करें। कोशिकाओं को 0.75 μg/ml प्यूरोमाइसिन युक्त माध्यम में बनाए रखना जारी रखें।

2) संलयित होने पर कोशिकाओं को विभाजित किया जाना चाहिए।

3) कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए (दी गई मात्रा यह मानकर दी गई है कि कोशिकाएँ T25 में हैं):

ए. स्टेराइल तकनीक का उपयोग करते हुए, मीडिया को हटाएँ और फ्लास्क को 2-3 मिली स्टेराइल HBSS से धोएँ। HBSS को हटाएँ और त्याग दें।

बी. 1 मिली ट्रिप्सिन डालें और 2-3 मिनट तक इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को उल्टे माइक्रोस्कोप से जांचना चाहिए ताकि पता चल सके कि वे गोल, ऊपर और तैरने लगी हैं या नहीं। अगर 3 मिनट के बाद भी कोशिकाएं अलग नहीं होती हैं, तो आप 1-2 मिनट और इनक्यूबेट कर सकते हैं

C. ढक्कन को कसें और सभी कोशिकाओं को हटाने के लिए फ्लास्क को धीरे से एक तरफ से दूसरी तरफ झुकाएँ। यदि आवश्यक हो तो कोशिकाओं को ढीला करने के लिए फ्लास्क को हल्के से साइड से थपथपाया जा सकता है।

डी. ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए जैसे ही कोशिकाएँ तैरने लगें, फ्लास्क में 4 मिली लीटर नया माध्यम डालें। प्लास्टिक से सभी कोशिकाओं को धोने और घोल में डालने के लिए फ्लास्क के किनारों को नए माध्यम से कई बार धोएँ। सभी तरल युक्त कोशिकाओं को निकालें और 15 मिली लीटर के शंक्वाकार (या 50 मिली लीटर यदि आप 3 या अधिक फ्लास्क जमा कर रहे हैं) में स्थानांतरित करें।

ई. स्टेराइल तकनीक का उपयोग करते हुए, हेमासाइटोमीटर पर गिनती के लिए एक अंश निकालें।

F. जब आप कोशिकाओं की गिनती कर रहे हों, तो शेष विलयन को क्लिनिकल सेंट्रीफ्यूज में 1000 आरपीएम पर 5 मिनट तक घुमाना चाहिए।

4) अपनी कोशिका गणना की गणना करने के बाद, कोशिकाओं को 2.5 x 10 पर प्लेट करें⁵ टी 25 फिल्टर टॉप फ्लास्क प्रति कोशिकाएं।

5) कोशिकाओं को हर 2-3 दिन में 0.75 μg/ml प्यूरोमाइसिन युक्त ताजा वृद्धि माध्यम दिया जाना चाहिए।

बर्फ जमना:

कोशिकाओं को 5x 10 से कम तापमान पर जमाया नहीं जाना चाहिए⁵ कोशिकाएं /एमएल/क्रायोविअल विकास माध्यम में 10% DMSO और 30% FBS युक्त प्यूरोमाइसिन के बिना और बाद में रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर आइसोप्रोपेनॉल फ्रीजिंग चैंबर में रखा जाता है। अगले दिन तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।

अधिक जानकारी के लिए कृपया संपर्क करें:

लेस्ली बी. गॉर्डन, एम.डी., पी.एच.डी.

ब्राउन यूनिवर्सिटी के वारेन अल्परट मेडिकल स्कूल में बाल चिकित्सा अनुसंधान के प्रोफेसर और हैस्ब्रो चिल्ड्रेन हॉस्पिटल, प्रोविडेंस, आरआई में बाल चिकित्सा विभाग, एनेस्थीसिया विभाग, चिल्ड्रेन हॉस्पिटल बोस्टन और हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, बोस्टन, एमए में चिकित्सा निदेशक, प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन

फ़ोन: 978-535-2594
फैक्स: 508-543-0377
lgordon@progeriaresearch.org

वेंडी नोरिस

पीआरएफ सेल और ऊतक बैंक
फ़ोन: 401-274-1122 x 48063
wnorris@brownhealth.org

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