Protokol untuk Budidaya Limfoblas

Media Pertumbuhan

RPMI 1640 – ThermoFisher # 11875
Serum Janin Sapi (FBS) 15% – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) Penisilin-Streptomisin (opsional) – ThermoFisher #15140-122

Catatan Umum

• Media pertumbuhan harus selalu diseimbangkan dalam inkubator pada suhu 37°C, 5% CO₂ selama 30 menit sebelum digunakan
• Selalu gunakan botol dengan tutup berventilasi
• Selalu inkubasi labu dalam posisi tegak
• Tidak lebih dari 20 ml harus digunakan dalam labu T25

Mencairkan Sel Beku

Sel beku akan diterima dalam alikuot 1 ml pada es kering. Simpan sel beku hingga dicairkan untuk kultur sel atau simpan dalam penyimpanan nitrogen cair jika tidak segera memulai kultur. Namun, jika Anda akan menyimpan sel untuk penggunaan selanjutnya, sebaiknya buat stok segar dan bekukan beberapa ampul. Sel dikriopreservasi dalam 45% RPMI-1640, 50% FBS, dan 5% DMSO (tingkat kultur jaringan).

1. 1. Tempatkan 10 ml RPMI-1640, 15% fetal bovine serum (FBS), ± antibiotik dalam labu T-25 dengan tutup berventilasi.
   2. Biarkan media mencapai keseimbangan dalam inkubator humidifikasi 37°C dengan 5% CO₂ di udara selama 30 menit. Labu harus diinkubasi dalam posisi tegak.
   3. Cairkan setiap ampul atau botol kecil berisi sel beku dalam air bersuhu 37°C atau gelas kimia berisi air hangat, satu per satu.
   4. Bersihkan bagian luar ampul atau vial dengan cepat menggunakan etanol 70%. Jika sel berada dalam ampul kaca, pecahkan ampul dengan hati-hati dan pastikan jari terlindungi dari pecahan kaca.
   5. Ambil 1 ml sel beku dengan pipet steril dan tempatkan dalam labu T-25 dengan 10 ml medium. Beri label pada labu dengan jelas untuk mengidentifikasi setiap lini sel.
   6. Tempatkan labu dalam inkubator humidifikasi 37°C dengan 5% CO₂ di udara. Labu harus diinkubasi dalam posisi tegak.
   7. Setelah 24 jam, keluarkan 5 ml media dari atas tanpa mengganggu limfosit yang mengendap di dasar labu dan ganti dengan 5 ml media yang telah dihangatkan sebelumnya.
   8. Lanjutkan dengan protokol kultur sel limfoblas.

Kultur Limfoblas

1. 1. Tiga hingga empat hari setelah pencairan, hitung sel-selnya. Sel-sel tidak melekat dan tumbuh dalam gumpalan. Pecahkan gumpalan dengan pipet yang lembut.
   2. Hitung sel.
   3. Idealnya, konsentrasi sel tidak boleh melebihi 2 x 10⁶ sel/ml.
   4. Bergantung pada konsentrasi sel, isi ulang, pisahkan, atau bekukan sel.
   5. Beri makan kembali dengan menambahkan 5-6 ml media pertumbuhan yang telah diseimbangkan.
   6. Tanam benih kultur baru minimal 2 x 10⁵ sel/ml.
   7. Sel harus dibekukan pada suhu sekitar 5 x 10⁶ sel/ml. Ikuti protokol pembekuan sel.

Pembekuan Limfoblas

1. 1. Sel harus dibekukan pada suhu sekitar 5 x 10⁶ sel/ml.
   2. Pindahkan volume sel yang sesuai ke dalam tabung kerucut 15 atau 50 ml.
   3. Sentrifus pada suhu 4°C pada 100 xg selama 10 menit.
   4. Keluarkan medium dan suspensikan kembali dalam volume medium pembeku dingin yang sesuai.
   5. Pindahkan masing-masing 1 ml sel ke dalam kriovial.
   6. Letakkan kriovial dalam ruang pembekuan dan letakkan ruang tersebut dalam freezer bersuhu -80°C semalaman.
   7. Pindahkan kriovial ke nitrogen cair keesokan harinya.

Wendy Norris