Scongelamento delle linee cellulari PRF

1. Scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua a 37˚C.
2. Pulire l'esterno della fiala con etanolo 70%.
3. Trasferire le cellule scongelate in un pallone T25 contenente 5 ml di terreno di coltura.
4. Mettere la beuta nell'incubatrice a 37˚C durante la notte.
5. Il giorno seguente, osservare al microscopio per assicurarsi che le cellule si siano attaccate.
6. Rimuovere il substrato e sostituirlo con un substrato di coltura fresco.

Subcoltura di linee cellulari PRF

1. Le cellule dovrebbero essere divise quando sono confluenti.
2. Per dividere le cellule (i volumi indicati presuppongono che le cellule siano in un T25):
   a) Utilizzando una tecnica sterile, rimuovere il terreno e sciacquare la beuta con 2-3 ml di HBSS sterile. Rimuovere e scartare l'HBSS.
   b) Aggiungere 1 ml di tripsina e incubare per 2-3 minuti. Le cellule devono essere controllate al microscopio invertito per determinare se hanno iniziato ad arrotondarsi, sollevarsi e galleggiare. Se le cellule non si sono staccate dopo 3 minuti, è possibile incubare altri 1-2 minuti.
   c) Stringere il tappo e inclinare delicatamente la beuta da un lato all'altro per rimuovere tutte le cellule. La beuta può essere picchiettata leggermente di lato per allentare le cellule, se necessario.
   d) Aggiungere 4 ml di nuovo terreno di coltura alla beuta non appena le cellule galleggiano per inattivare la tripsina. Risciacquare i lati della beuta più volte con il nuovo terreno di coltura per lavare via tutte le cellule dalla plastica e nella soluzione. Rimuovere tutto il liquido contenente le cellule e trasferire in un contenitore conico da 15 ml (o 50 ml se si mettono insieme 3 o più beute).
   e) Utilizzando una tecnica sterile, prelevare un'aliquota per il conteggio su un emocitometro.
   f) Mentre si contano le cellule, il resto della soluzione deve essere centrifugato nella centrifuga clinica per 5 minuti a 1000 giri al minuto.
3. Dopo aver calcolato il conteggio delle cellule, piastrare le cellule a 2,5 x 10⁵ cellule per pallone con filtro T25.
4. Le cellule devono essere nutrite ogni 2-3 giorni con un nuovo terreno di coltura.

Congelamento:

Le cellule devono essere congelate a non meno di 5 x 10⁵ cellule/ml/cryovial in terreni di coltura contenenti 10% DMSO e 30% FBS e successivamente poste in una camera di congelamento con isopropanolo a -80˚C durante la notte. Trasferire nell'azoto liquido il giorno successivo.

Protocollo per la subcoltura e il congelamento dei fibroblasti