Tripsina

Tripsina EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)

Soluzione salina bilanciata di Hank

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) cloruro di calcio, (-) cloruro di magnesio, (-) solfato di magnesio)

DMSO per il congelamento

DMSO di grado di coltura cellulare

Le cellule arriveranno congelate su ghiaccio secco ad una concentrazione di circa 5 x 10⁵cellule/fiala

Protocollo per lo scongelamento dei fibroblasti

1. Scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua a 37°C.
2. Pulire l'esterno della fiala con etanolo 70%.
3. Trasferire le cellule scongelate in un pallone T25 contenente 5 ml di terreno di coltura senza puromicina.
4. Mettere la beuta nell'incubatrice a 37°C durante la notte.
5. Il giorno seguente, osservare al microscopio per assicurarsi che le cellule si siano attaccate.
6. Rimuovere il substrato e sostituirlo con un substrato di coltura fresco.

Subcoltura di linee cellulari PRF

1) Quando le cellule sono stabilizzate e in crescita, iniziare a usare un terreno contenente 0,75 μg/ml di puromicina. Continuare a mantenere le cellule in un terreno contenente 0,75 μg/ml di puromicina.

2) Le cellule devono essere divise quando sono confluenti.

3) Per dividere le cellule (i volumi indicati presuppongono che le cellule siano in un T25):

A. Utilizzando una tecnica sterile, rimuovere il terreno e sciacquare la beuta con 2-3 ml di HBSS sterile. Rimuovere e scartare l'HBSS.

B. Aggiungere 1 ml di tripsina e incubare per 2-3 minuti. Le cellule devono essere controllate al microscopio invertito per determinare se hanno iniziato ad arrotondarsi, sollevarsi e galleggiare. Se le cellule non si sono staccate dopo 3 minuti, è possibile incubare altri 1-2 minuti

C. Serrare il tappo e inclinare delicatamente la beuta da un lato all'altro per rimuovere tutte le cellule. La beuta può essere picchiettata leggermente di lato per allentare le cellule, se necessario.

D. Aggiungere 4 ml di nuovo terreno di coltura alla beuta non appena le cellule galleggiano per inattivare la tripsina. Risciacquare i lati della beuta più volte con il nuovo terreno di coltura per lavare via tutte le cellule dalla plastica e nella soluzione. Rimuovere tutto il liquido contenente le cellule e trasferire in una beuta conica da 15 ml (o 50 ml se si mettono insieme 3 o più beute).

E. Utilizzando una tecnica sterile, prelevare un'aliquota per il conteggio su un emocitometro.

F. Mentre si contano le cellule, il resto della soluzione deve essere centrifugato nella centrifuga clinica per 5 minuti a 1000 giri al minuto.

4) Dopo aver calcolato il conteggio delle cellule, piastrare le cellule a 2,5 x 10⁵ cellule per pallone con filtro T 25.

5) Le cellule devono essere alimentate ogni 2-3 giorni con un terreno di coltura fresco contenente 0,75 μg/ml di puromicina.

Congelamento:

Le cellule devono essere congelate a non meno di 5x 10⁵ cellule /ml/crioviale nei terreni di coltura contenente 10% DMSO e 30% FBS senza puromicina e successivamente posto in una camera di congelamento con isopropanolo a -80°C durante la notte. Trasferire nell'azoto liquido il giorno successivo.

Wendy Norris