1. Informazioni di base sull'iPSC per i non scienziati

Le cellule staminali sono cellule "immature" che non si sono ancora impegnate a diventare un tipo di cellula. Sono flessibili perché hanno il potenziale per svilupparsi in molti tipi diversi di cellule mature nel corpo, come le cellule che compongono il cuore o i vasi sanguigni e altri tessuti e organi. Nel 2007, i ricercatori hanno scoperto una strategia per creare cellule staminali in laboratorio riprogrammando le cellule adulte mature che comunemente coltiviamo per scopi di ricerca.^{1, 2} . Queste cellule staminali create artificialmente sono chiamate cellule staminali pluripotenti indotte ("iPSC"). Per il campo della Progeria, questa è una svolta enorme. Per la prima volta, gli scienziati possono ora creare cellule staminali di Progeria e porre domande su come funzionano e si sviluppano le cellule staminali nella Progeria. In precedenza non esisteva alcuna fonte di cellule staminali umane di Progeria e quindi c'era un vuoto di informazioni su come funzionano le cellule staminali di Progeria rispetto alle cellule staminali di persone senza Progeria. Inoltre, gli scienziati possono riprogrammare le cellule staminali di Progeria per creare, per la prima volta, vasi sanguigni maturi di Progeria, cellule cardiache e altri tipi di cellule. Fino ad ora, non esisteva alcuna fonte di cellule cardiache o dei vasi sanguigni di Progeria umana.  Ora possiamo chiedere la chiave domande sulla malattia cardiaca che porta alla morte precoce nella Progeria per infarti e ictus. Possiamo confrontare queste scoperte con la malattia cardiaca e l'invecchiamento nella popolazione generale e scoprire di più su cosa influenza l'invecchiamento in tutti noi. Sono già stati pubblicati diversi studi eccellenti che utilizzano le cellule staminali della Progeria.^3-5  Il nostro obiettivo alla Progeria Research Foundation è quello di facilitare molte altre scoperte utilizzando questo strumento inestimabile. Per un primer sulle cellule staminali, consulta questo sito web del governo degli Stati Uniti: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Scopo della generazione e distribuzione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da parte della Progeria Research Foundation

La missione della Progeria Research Foundation è scoprire trattamenti e la cura per la sindrome di Hutchinson-Gilford Progeria e i disturbi correlati all'invecchiamento. Nel 2009, PRF ha avviato una collaborazione con un team di esperti scienziati presso l'Università di Toronto, Canada, sotto la direzione di William Stanford, PhD, per generare iPSC di Progeria di alta qualità. Il dott. Stanford è il Canada Research Chair in Integrative Stem Cell Biology. Dal 2011, PRF continua a collaborare con il dott. Stanford presso l'Università di Ottawa, Canada, dove è professore di medicina cellulare e molecolare, facoltà di medicina e scienziato senior presso lo Sprott Centre for Stem Cell Research dell'Ottawa Hospital Research Institute.

Il nostro obiettivo è quello di fornire questo strumento inestimabile ai ricercatori di tutto il mondo. Questo nuovo strumento di ricerca sarà utilizzato per generare ricerche nuove e innovative sulla Progeria, nonché sulla sua relazione con le malattie cardiache e l'invecchiamento.  

3. Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte dalla sindrome di progeria di Hutchinson-Gilford (iPSC)

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono state derivate utilizzando la trasduzione retrovirale pseudotipizzata VSVG di quattro fattori umani, Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc nei fibroblasti. Le colonie di iPSC sono state derivate su fibroblasti embrionali di topo (MEF). La procedura utilizzata era essenzialmente come precedentemente descritta ma senza l'uso del reporter EOS (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Controllo di qualità: convalida e caratterizzazione

Le linee attualmente disponibili sono state sottoposte a diversi passaggi di convalida (vedere i PDF scaricabili di seguito):

5. Materiale di partenza originale da cui sono state derivate queste cellule iPS

Le cellule iPSC sono state derivate da linee cellulari di fibroblasti non trasformati della PRF Cell & Tissue Bank.

Il metodo di trasduzione utilizzato per tutte le linee iPS è stato Retrovirus MKOS.

ID linea iPSC	Mutazione	Genere e donazioneEtà	Tipo di cellula originaria clicca qui.	Dati di supporto
HGADFN003 iPS 1B	LMNAEsone 11, 1824 C>T	Maschio 2 anni 0 mesi	Fibroblasti dermici Numero di modello: HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA Esone 11, 1824 C>T	Maschio 2 anni 0 mesi	Fibroblasti dermici Numero di modello: HGADFN003	003 iPS1C
Numero di modello: HGDFN003 iPS 1D	LMNA Esone 11, 1824 C>T	Maschio 2 anni 0 mesi	Fibroblasti dermici Numero di modello: HGADFN003	003 iPS1D
Scheda madre HGADFN167 iPS 1J	LMNA Esone 11, 1824 C>T	Maschio 8 anni 5 mesi	Fibroblasti dermici HGADFN167	167 CV 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA Esone 11, 1824 C>T	Maschio 8 anni 5 mesi	Fibroblasti dermici HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	Madre di HGADFN167 (non affetta)	Donna 37 anni 10 mesi	Fibroblasti dermici Numero di modello: HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	Madre di HGADFN167 (non affetta)	Donna 37 anni 10 mesi	Fibroblasti dermici Numero di modello: HGMDFN090	090 iPS1C
Scheda madre HGFDFN168 iPS1 D2	Padre di HGADFN167 (non affetto)	Maschio 40 anni 5mo	Fibroblasti dermici HGFDFN168	168 iPS1 D2
Modello HGFDFN168 iPS1P	Padre di HGADFN167 (non affetto)	Maschio 40 anni 5mo	Fibroblasti dermici Numero di modello: HGFDFN168	168 iPS1P

6. Iscriviti alla nostra mailing list per ricevere futuri aggiornamenti sulle iPSC e sulle nuove linee cellulari

Stiamo continuando a generare linee iPSC. Se desideri aggiornamenti periodici sulle iPSC conservate nella PRF Cell & Tissue Bank, unisciti alla nostra mailing list cliccando su Qui

7. Domande?

Per qualsiasi domanda o necessità, contattare Leslie Gordon, MD, PhD, Direttore medico, all'indirizzo lgordon@progeriaresearch.org o 978-535-2594

8. Ordinazione delle linee cellulari iPS

Nel 2014, PRF ha istituito una politica di non modifica del nostro MTA. Questo è il risultato di 12 anni di accordi contrattuali con 70 team di ricerca che lavorano presso istituzioni in 14 paesi. PRF e il suo consulente hanno preso in considerazione i problemi emersi in quel periodo di tempo e hanno modificato l'accordo di conseguenza, con il risultato che riteniamo siano termini equi e ragionevoli.

Per le istituzioni del governo federale degli Stati Uniti o per domande, contattare Wendy Norris a: e-mail: wnorris@brownhealth.org O 401-274-1122 x 48063.

Fase 1: Completare una domanda e un accordo di trasferimento del materiale

Domanda e accordo per istituzioni non governative

Accordo di trasferimento di materiale per istituzioni non governative

Fase 2: Restituire la domanda compilata e l'accordo di trasferimento del materiale a Wendy Norris a e-mail: wnorris@brownhealth.orgUna volta approvato, riceverai un'e-mail di conferma dell'ordine e la data di spedizione prevista. 

Fase 3: Il laboratorio del dott. Stanford sta attualmente distribuendo linee in criovial congelate. Il suo laboratorio ti invierà un'e-mail quando la coltura sarà stata spedita, con informazioni sulla spedizione e sul tracciamento. I ricercatori inesperti sono indirizzati a ottenere una formazione presso corsi specializzati essenziali per il lavoro sulle cellule staminali embrionali umane/iPSC.

La Human Pluripotent Stem Cell Facility (diretta dal dott. Stanford) presso l'Ottawa Hospital Research Institute offre una formazione virtuale individuale sui fondamenti delle tecniche di coltura iPSC specifiche per le linee cellulari iPSC di Progeria. Le opzioni di formazione e il formato sono flessibili a seconda del livello di esperienza degli scienziati.  Per ulteriori informazioni, inviare un'e-mail a hpscf@ohri.ca.

Fase 4: L'Università di Ottawa ti fatturerà direttamente ogni riga iPSC, più eventuali costi di spedizione.

9. Preparazione del terreno di coltura cellulare HGPS e iPS di controllo

iPSC ed ESC devono essere alimentati con mTeSR Plus di Stem Cell Technologies (cat# 5825). Si prega di seguire le raccomandazioni del fornitore per la conservazione.

10. Preparazione delle piastre di Matrigel

Nota: Tutti i passaggi che coinvolgono il matrigel devono essere eseguiti il più rapidamente possibile e mantenuti il più freddi possibile.

1. Scongelare la bottiglia di matrigel a 4°C. Controllare il certificato di analisi di quel lotto per scoprirne la concentrazione proteica.
2. Aggiungere al matrigel scongelato una quantità sufficiente di terreno DMEM/F12 freddo per raggiungere una concentrazione finale di 5 mg/mL.
3. Preparare aliquote da 1 ml del matrigel preparato nel passaggio 2 in provette Falcon da 15 ml preraffreddate.
4. Congelare e conservare tutti gli aliquote a -20°C.
5. Per realizzare le piastre di matrigel, rimuovere un'aliquota di matrigel (1 ml) da -20°C e aggiungere 10 ml di DMEM/F12 freddo. Mescolare bene fino a quando il pellet non si scongela (senza creare bolle e mantenere sempre la soluzione fredda).
6. Trasferire in una provetta da 50 ml, quindi aggiungere 20 ml di DMEM/F12 freddo (1 ml di aliquota di matrigel viene diluita in 30 ml di DMEM/F12), mescolare bene.
7. Piastra (1 mL/pozzetto per piastra a 6 pozzetti, 0,5 mL/pozzetto per piastra a 12 pozzetti, 0,25 mL/pozzetto per piastra a 24 pozzetti). Assicurarsi che la soluzione copra l'intera superficie agitando delicatamente la piastra. Non ricongelare il matrigel rimasto.
8. Se si utilizza la piastra immediatamente, lasciarla a temperatura ambiente per 1 ora (o 30 minuti a 37°C), osservare il matrigel al microscopio. Il matrigel deve essere ben disperso e non "grumoso".
9. Se si utilizzano le piastre in un altro momento, avvolgere il bordo della piastra con parafilm e conservare a 4°C per un massimo di 2 settimane.

Matrigel – BD/Fisher, cat#CB-40230

DMEM/F12 – Tecnologie della vita, cat#11330-057

Dott. William Stanford-2022

11. Scongelamento delle cellule ES o iPS (per crio-fiala)

1. Togliere una piastra di matrigel da 4°C e riscaldarla a temperatura ambiente per un'ora, oppure preparare una nuova piastra di matrigel (vedere il protocollo di preparazione della piastra di matrigel).
2. Riscaldare 4 ml di mTeSR Plus in una provetta Falcon da 15 ml.
3. Togliere le cellule dal serbatoio di azoto liquido e agitarle in un bagno a 37°C finché non rimane solo un piccolo pezzo di ghiaccio. La fiala dovrebbe scongelarsi in 1-2 minuti. Questo passaggio deve essere eseguito rapidamente.
4. Provetta con cella all'etanolo e provetta con terreno Falcon e posizionarle nella cappa.
5. Utilizzare 1 ml bocca larga punta lentamente aggiungere le cellule a 4 ml di terreno preriscaldato (evitare di mescolare la sospensione cellulare).
6. Centrifugare a 130 rcf per 5 minuti.
7. Rimuovere il surnatante.
8. Aggiungere 2 ml di terreno PSC e, con una punta a bocca larga rompere delicatamente i grumi. Trasferire il terreno in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, aggiungere 2uL di inibitore ROCK (Y27632, concentrazione finale di 10uM). Piastrare in un pozzetto rivestito di matrigel (di una piastra a 6 pozzetti).
9. Scuotere delicatamente le cellule per distribuirle uniformemente e posizionarle in un'incubatrice ipossica (5%O₂, 10% CO₂). Evitare di disturbare la piastra per 24 ore dopo la semina.

   NOTA: È molto importante evitare un'eccessiva rottura dei grumi o un pipettaggio aggressivo. Ciò può ridurre significativamente il tasso di sopravvivenza. Le cellule dovrebbero rimanere in blocchi da 100-300 cellule al momento della semina. Pur essendo delicati, prova a lavorare rapidamente una volta che le cellule sono scongelate per ridurre al minimo il tempo in cui sono a contatto con il crioprotettore.

10. Rimuovere il terreno di coltura dopo 24 ore e aggiungere 2 mL di terreno di coltura PSC (per una piastra a 6 pozzetti, 1 mL per una piastra a 12 pozzetti e 0,5 mL per una piastra a 24 pozzetti). Vedere il protocollo Raccolta e cura di hESC/iPSC.

Supporto PSC

mTeSR Plus di Stem Cell Technologies (cat# 5825). Per la conservazione, seguire le raccomandazioni del fornitore.

Che cos'è l'inibitore ROCK Y27632?

L'inibitore ROCK Y27632 è un inibitore selettivo della chinasi associata a Rho p160 ROCK. Il trattamento con l'inibitore ROCK Y27632 previene l'apoptosi indotta dalla dissociazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) e delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC), aumentando il tasso di sopravvivenza e mantenendo la pluripotenza durante la subcoltivazione e lo scongelamento di hESC e hiPSC. È stato anche dimostrato che l'inibitore ROCK Y27632 aumenta il tasso di sopravvivenza delle cellule staminali durante la crioconservazione. Si noti che le aliquote dell'inibitore Rock sono sensibili alla luce e ai cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. Assicurarsi di utilizzare queste aliquote entro la data di scadenza consigliata dal fornitore.

Dott. William Stanford-2022

12. Raccolta e cura di hESC/iPSC

1. Il giorno dopo lo scongelamento delle cellule, osservale al microscopio per determinare il tasso di sopravvivenza. NOTA: è normale osservare un numero elevato di cellule non attaccate. Finché alcune cellule sono attaccate, possono formarsi colonie da esse entro 3-7 giorni.
2. Rimuovere il terreno dai pozzetti e pipettare 2 mL (per una piastra da 6 pozzetti, 1 mL per una piastra da 12 pozzetti e 0,5 mL per una piastra da 24 pozzetti) di terreno PSC fresco e caldo per pozzetto. Rimettere la piastra nell'incubatrice.
3. Le cellule vengono alimentate fino a raggiungere la confluenza 60-70% (seguire le raccomandazioni del fornitore).
4. A partire dal secondo giorno, le cellule devono essere osservate e pulite da eventuali cellule differenziate in crescita.
5. Per pulire le cellule, utilizzare la cappa di aspirazione e raschiare via le cellule differenziate con la punta di una pipetta.
6. Una volta pulite le celle, sostituire il supporto come descritto nei passaggi precedenti.

(Vedere Congelamento di hESC/iPSC o Passaggio di hESC/iPSC)

NOTA:

È stato determinato che il terreno PSC è più efficiente in un ambiente ipossico. Abbiamo anche osservato che si verifica una minore differenziazione quando le cellule vengono coltivate in incubatori ipossici rispetto a quelli normossici. Infine, le cellule seminate hanno un tasso di sopravvivenza migliore quando si utilizza un incubatore ipossico.

Normossico: 37°C, 21% O₂, 5% CO₂

Ipossico: 37°C, 5%O₂, 10% CO₂

Dott. William Stanford-2022

13. Superamento dell'hESC/iPSC

1. Aggiungere 2 ml di terreno PSC in una piastra da 6 pozzetti rivestita con matrigel e mettere da parte.
2. Prendere la piastra da far passare, rimuovere il terreno di coltura dal pozzetto e lavare una volta con 1 ml di PBS(-/-).
3. Aggiungere 1mL di soluzione EDTA al pozzetto e lasciare per 3-4 minuti a temperatura ambiente. Non muovere la piastra perché le cellule potrebbero iniziare a staccarsi.
4. Rimuovere la soluzione EDTA e aggiungere 1 mL di terreno PSC. Non lasciare EDTA sulle cellule per più di 4 minuti, poiché ciò causerà il sollevamento delle cellule.
5. Raschiare le cellule utilizzando un raschietto per cellule e dividerle tra i 6 pozzetti della piastra contenente il terreno PSC. Evitare di rompere eccessivamente i pezzi di colonia e cercare di essere delicati con la raschiatura. Cercare di mantenere le cellule in grandi pezzi. Utilizzare una punta di pipetta a bocca larga per rompere i grumi, se necessario. Una rottura eccessiva delle cellule può causare la morte cellulare o un'eccessiva differenziazione spontanea dopo il passaggio.
6. Incubare a 37°C dopo aver distribuito uniformemente le cellule in ogni pozzetto (agitazione a forma di 8 o L). Evitare di disturbare la piastra per 24 ore dopo il passaggio.

NOTA: Una volta raschiate le cellule, è opportuno trasferirle sulla nuova piastra il prima possibile, perché si riattaccheranno rapidamente (entro 5 minuti).

Se l'EDTA viene lasciato sulle cellule per più di 4 minuti, le cellule possono iniziare a staccarsi. Se ciò accade, raccogliere semplicemente le cellule in un falcon da 15 mL con 4 mL di terreno PSC. Centrifugare le cellule a 130 rcf per 5 minuti. Risospendere il pellet con 1 mL di terreno e dividerlo uniformemente tra una piastra rivestita di matrigel a 6 pozzetti (160 µL per pozzetto).

Soluzione EDTA: aggiungere 500uL di EDTA 0,5M (pH 8,0) in 500mL di DPBS (-/-). Aggiungere 0,9g di NaCl. Filtrare la soluzione per sterilizzarla e conservarla a 4°C fino a 6 mesi.

Dal documento:

Passaggio ed espansione delle colonie di cellule staminali pluripotenti umane mediante dissociazione senza enzimi in condizioni di coltura chimicamente definite

Birre Jeanette,¹ Daniele R. Gulbranson,^2,3 Nicole Giorgio,⁴Lauren I. Siniscalchi,¹ Italiano: Jeffrey Jones,^4,5 Giacomo A. Thomson,^2,3,6 E Chen Guokai^1,2

14. Congelamento di hESC/iPSC

1. Accendere Bio-Cool (congelatore a velocità controllata) e regolare la temperatura a -7°C.
2. Rimuovere le cellule dall'incubatrice e osservare la confluenza e la morfologia al microscopio.
3. Se i pozzetti sono confluenti 70%, rimuovere il vecchio terreno e lavare una volta con PBS(-/-), quindi aggiungere 1 mL di soluzione di EDTA (vedere passaggio con soluzione di EDTA) per pozzetto.
4. Incubare a temperatura ambiente per 3-4 minuti.
5. Aspirare la soluzione EDTA e aggiungere 1 mL di terreno mFreSR freddo (cat#05855, Stem Cell Technologies).
6. Utilizzare un raschietto per sollevare delicatamente le cellule. Mantenere le cellule in grossi pezzi il più possibile ed evitare di pipettare su e giù.
7. Trasferire cellule/mFreSR in una criotubo utilizzando una punta a bocca larga. Tenere le fiale su ghiaccio finché non si è pronti per il passaggio 8.
8. Posizionare le provette nel Bio-Cool e incubare per 10 minuti.
9. Procuratevi azoto liquido.
10. Dopo 10 minuti, seminare le cellule immergendo una spatola nell'azoto liquido e toccando il lato della crio-fiala per circa 10-30 secondi o finché non si vede formarsi un cristallo sul lato della crio-fiala.
11. Avviare il programma 1 premendo il pulsante “PROG” e scorrere il programma premendo nuovamente il pulsante e si dovrebbe vedere la velocità di 0,5°C/min., quindi premere “RUN”.
12. Una volta raggiunta la temperatura di -65°C, le crioprovette possono essere trasferite e conservate in azoto liquido.

Alternative

Un'altra opzione è quella di mettere le crio-provette in un contenitore di congelamento (Biocision-CoolCell) e conservarle a -80°C durante la notte. Spostare le crio-provette in azoto liquido (fase liquida o di vapore) il giorno seguente.

Dott. William Stanford-2022