PRF 세포주 해동

1. 37˚C 수조에서 세포를 빠르게 녹입니다.
2. 70% 에탄올로 바이알 외부를 닦습니다.
3. 해동된 세포를 5ml의 성장 배지가 들어 있는 T25 플라스크로 옮깁니다.
4. 플라스크를 37˚C 인큐베이터에 밤새 넣어둡니다.
5. 다음 날, 현미경으로 관찰하여 세포가 부착되었는지 확인하세요.
6. 배지를 제거하고 새로운 성장 배지로 교체합니다.

PRF 세포주 하위 배양

1. 세포는 합류할 때 분할되어야 합니다.
2. 셀을 분할하려면(주어진 볼륨은 셀이 T25에 있다고 가정함):
   a) 멸균 기술을 사용하여 배지를 제거하고 2-3ml의 멸균 HBSS로 플라스크를 헹굽니다. HBSS를 제거하고 폐기합니다.
   b) 트립신 1ml를 넣고 2~3분간 배양합니다. 세포를 역현미경으로 검사하여 둥글게 뭉쳐지고, 들어올려지고, 떠다니기 시작했는지 확인해야 합니다. 3분 후에도 세포가 분리되지 않으면 1~2분 더 배양할 수 있습니다.
   c) 캡을 조이고 플라스크를 좌우로 살짝 기울여 모든 세포를 제거합니다. 필요한 경우 플라스크를 가볍게 두드려 세포를 느슨하게 할 수 있습니다.
   d) 세포가 떠다니는 즉시 플라스크에 새로운 배지 4ml를 넣어 트립신을 불활성화합니다. 플라스크 측면을 새로운 배지로 여러 번 헹구어 플라스틱에서 모든 세포를 씻어내고 용액으로 옮깁니다. 세포가 들어 있는 모든 액체를 제거하고 15ml 원뿔형(또는 3개 이상의 플라스크를 모을 경우 50ml)으로 옮깁니다.
   e) 무균 기술을 사용하여 일정량의 샘플을 꺼내 혈구계산기로 측정합니다.
   f) 세포를 세는 동안 나머지 용액은 임상용 원심분리기에서 1000rpm으로 5분 동안 회전시킵니다.
3. 세포 수를 계산한 후, 세포를 2.5 x 10⁵ T25 필터 상부 플라스크당 세포 수.
4. 세포에는 2~3일에 한 번씩 새로운 성장 배지를 공급해야 합니다.

동결:

세포는 최소 5 x 10에서 동결되어야 합니다.⁵ 10% DMSO와 30% FBS를 함유한 성장 배지에 세포/ml/cryovial을 넣고, 그 후 -80˚C의 이소프로판올 냉동실에 밤새 두었다. 다음날 액체 질소로 옮긴다.

섬유아세포의 배양 및 동결을 위한 프로토콜