1. 비과학자를 위한 iPSC 배경 정보

줄기세포는 아직 어떤 세포 유형이 되지 않은 "미성숙" 세포입니다. 줄기세포는 신체에서 심장이나 혈관을 구성하는 세포, 기타 조직 및 장기와 같이 다양한 유형의 성숙 세포로 발달할 잠재력이 있기 때문에 유연합니다. 2007년 연구자들은 연구 목적으로 일반적으로 배양하는 성숙한 성체 세포를 재프로그래밍하여 실험실에서 줄기세포를 만드는 전략을 발견했습니다.^{1, 2} . 인공적으로 생성된 이러한 줄기 세포는 유도 다능성 줄기 세포("iPSC")라고 합니다. 프로게리아 분야에서 이는 엄청난 돌파구입니다. 과학자들은 처음으로 프로게리아 줄기 세포를 만들고 프로게리아에서 줄기 세포가 어떻게 기능하고 발달하는지에 대한 질문을 할 수 있습니다. 이전에는 인간 프로게리아 줄기 세포의 공급원이 없었기 때문에 프로게리아가 없는 사람의 줄기 세포와 비교하여 프로게리아 줄기 세포가 어떻게 기능하는지에 대한 정보가 부족했습니다. 또한 과학자들은 프로게리아 줄기 세포를 재프로그래밍하여 처음으로 성숙한 프로게리아 혈관, 심장 세포 및 기타 세포 유형을 생성할 수 있습니다. 지금까지 인간 프로게리아 심장 또는 혈관 세포의 공급원이 없었습니다.  이제 우리는 키를 물어볼 수 있습니다 심장마비와 뇌졸중으로 인해 조기 사망하는 프로게리아의 심장병에 대한 질문. 우리는 이러한 발견을 일반 인구의 심장병과 노화와 비교하고 우리 모두의 노화에 영향을 미치는 요소에 대해 더 많이 알아낼 수 있습니다. 프로게리아 줄기 세포를 사용한 훌륭한 연구가 이미 여러 건 발표되었습니다.^3-5  Progeria Research Foundation의 목표는 이 귀중한 도구를 사용하여 더 많은 발견을 촉진하는 것입니다. 줄기 세포에 대한 입문서는 이 미국 정부 웹사이트를 참조하세요. https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Progeria Research Foundation의 유도만능줄기세포(iPSC) 생성 및 배포 목적

Progeria Research Foundation의 사명은 Hutchinson-Gilford Progeria 증후군과 노화 관련 장애에 대한 치료법과 완치법을 발견하는 것입니다. 2009년 PRF는 William Stanford 박사의 지휘 아래 캐나다 토론토 대학의 전문가 과학자 팀과 협력하여 고품질 Progeria iPSC를 생성했습니다. Stanford 박사는 통합 줄기 세포 생물학 분야의 캐나다 연구 의장입니다. 2011년 현재 PRF는 캐나다 오타와 대학의 Stanford 박사와 협력을 계속하고 있으며, 그는 의학부 세포 및 분자 의학 교수이자 오타와 병원 연구소의 Sprott 줄기 세포 연구 센터의 수석 과학자입니다.

저희의 목표는 이 귀중한 도구를 전 세계 연구자들에게 제공하는 것입니다. 이 새로운 연구 도구는 프로게리아와 심장병 및 노화와의 관계에 대한 새롭고 혁신적인 연구를 생성하는 데 사용될 것입니다.  

3. 허친슨-길포드 프로게리아 증후군 유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 생성

유도만능줄기세포(iPSC)는 4가지 인간 인자인 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc를 섬유아세포로 VSVG-가성형 역전사바이러스로 형질 도입하여 유래했습니다. iPSC 콜로니는 마우스 배아 섬유아세포(MEF)에서 유래했습니다. 사용된 절차는 기본적으로 이전에 설명한 대로 했지만 EOS 리포터를 사용하지 않았습니다(Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. 품질 관리: 검증 및 특성화

현재 이용 가능한 라인은 여러 검증 단계를 거쳤습니다(아래에서 다운로드 가능한 PDF 참조):

5. 이들 iPS 세포가 유래된 원래 원료 물질

iPSC는 PRF 세포 및 조직 은행의 형질전환되지 않은 섬유아세포 세포주에서 유래되었습니다.

모든 iPS 세포주에 사용된 형질도입 방법은 레트로바이러스 MKOS였습니다.

iPSC 라인 ID	돌연변이	성별 및 기부 연령	기원 세포 유형 여기를 클릭하세요.	지원 데이터
HGADFN003 iPS 1B	LMNA엑손 11, 1824 C>T	남자 2년 0개월	피부섬유아세포 HGADFN003 (주)	003 아이피에스1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA 엑손 11, 1824 C>T	남자 2년 0개월	피부섬유아세포 HGADFN003 (주)	003 아이피에스1C
HGDFN003 iPS 1D	LMNA 엑손 11, 1824 C>T	남자 2년 0개월	피부섬유아세포 HGADFN003 (주)	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA 엑손 11, 1824 C>T	남자 8세 5개월	피부섬유아세포 HGADFN167	167마력 1주
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA 엑손 11, 1824 C>T	남자 8세 5개월	피부섬유아세포 HGADFN167	167 아이에스피에스1큐
HGMDFN090 iPS 1B	HGADFN167의 어머니(영향받지 않음)	여자 37세 10개월	피부섬유아세포 HGMDFN090	090 아이피에스1B
HGMDFN090 iPS 1C	HGADFN167의 어머니(영향받지 않음)	여자 37세 10개월	피부섬유아세포 HGMDFN090	090 iPS1C
HGFFDN168 iPS1 D2	HGADFN167의 아버지(영향받지 않음)	남자 40세 5개월	피부섬유아세포 HGFFDN168	168 iPS1 D2
HGFFDN168 iPS1P	HGADFN167의 아버지(영향받지 않음)	남자 40세 5개월	피부섬유아세포 HGFFDN168	168 아이에스피에스1P

6. 향후 iPSC 업데이트 및 새로운 세포주에 대한 이메일 목록에 가입하세요.

우리는 iPSC 라인을 계속 생성하고 있습니다. PRF 세포 및 조직 은행에 보관된 iPSC에 대한 주기적 업데이트를 원하시면 클릭하여 이메일 목록에 가입하세요. 여기

7. 질문있으세요?

질문이나 필요 사항이 있으시면 의료 책임자인 Leslie Gordon, MD, PhD에게 연락해 주십시오. lgordon@progeriaresearch.org 또는 978-535-2594

8. iPS 세포주 주문

2014년에 PRF는 MTA에 대한 변경 없음 정책을 제정했습니다. 이는 14개국의 기관에서 일하는 70개 연구팀과 12년간의 계약적 합의의 결과입니다. PRF와 그 자문은 그 기간 동안 발생한 문제를 고려하고 그에 따라 계약을 편집하여 우리가 공정하고 합리적인 조건이라고 생각하는 결과를 얻었습니다.

미국 연방 정부 기관 또는 문의사항은 Wendy Norris에게 문의하세요. wnorris@brownhealth.org 또는 401-274-1122 x 48063.

1단계: 신청서 및 물질 이전 계약서 작성

비정부기관 신청 및 협정

비정부 기관을 위한 물질 이전 계약

2단계: 완성된 신청서와 자재 이전 계약서를 Wendy Norris에게 반환하십시오. wnorris@brownhealth.org승인되면 주문 확인 및 예상 배송 날짜가 적힌 이메일을 받게 됩니다. 

3단계: 스탠포드 박사의 연구실은 현재 냉동 크라이오바이얼에 라인을 배포하고 있습니다. 그의 연구실은 배양물이 발송되면 발송 및 추적 정보와 함께 이메일을 보내드립니다. 경험이 부족한 연구자는 인간 배아줄기세포/iPSC 작업에 필수적인 전문 과정에서 교육을 받도록 지시받습니다.

오타와 병원 연구소의 인간 다능성 줄기 세포 시설(스탠포드 박사가 지휘)은 Progeria iPSC 세포주에 특화된 iPSC 배양 기술의 기본에 대한 가상 일대일 교육을 제공합니다. 교육 옵션과 형식은 과학자의 경험 수준에 따라 유연하게 달라집니다.  자세한 내용은 hpscf@ohri.ca로 이메일을 보내주세요..

4단계: 오타와 대학교에서는 각 iPSC 라인에 대해 직접 청구서를 발송하며, 택배 비용도 함께 청구합니다(있는 경우).

9. HGPS 및 Control iPS 세포 배양 배지 준비

iPSC와 ESC는 Stem Cell Technologies(cat# 5825)의 mTeSR Plus를 공급해야 합니다. 보관에 대한 공급업체의 권장 사항을 따르세요.

10. 마트리젤 플레이트 준비

메모: 마트리젤과 관련된 모든 단계는 가능한 한 빨리 이루어져야 하며 가능한 한 차갑게 유지해야 합니다.

1. 마트리젤 병을 4도에서 녹입니다.°C. 해당 품목의 분석 인증서를 확인하여 단백질 농도를 확인하세요.
2. 해동된 마트리젤에 최종 농도가 5mg/mL이 될 때까지 차가운 DMEM/F12 배지를 충분히 첨가합니다.
3. 2단계에서 준비한 마트리젤을 미리 냉각해 둔 15mL 팔콘 튜브에 1mL씩 분주합니다.
4. 모든 알리쿼트를 -20에서 동결하고 보관하십시오.°기음.
5. 마트리겔 플레이트를 만들려면 -20에서 마트리겔 한 조각(1mL)을 꺼냅니다.°C에 차가운 DMEM/F12 10mL를 더합니다. 펠릿이 녹을 때까지 잘 섞습니다(거품이 생기지 않게 하고, 용액은 항상 차갑게 유지).
6. 50mL 튜브에 옮긴 후, 차가운 DMEM/F12 20mL을 첨가합니다(마트리겔 분주물 1mL을 DMEM/F12 30mL에 희석). 잘 섞습니다.
7. 플레이트(6웰 플레이트의 경우 1mL/웰, 12웰 플레이트의 경우 0.5mL/웰, 24웰 플레이트의 경우 0.25mL/웰). 플레이트를 가볍게 흔들어 용액이 전체 표면을 덮고 있는지 확인하십시오. 남은 마트리젤을 다시 얼리지 마십시오.
8. 플레이트를 즉시 사용하는 경우 플레이트를 실온에 1시간(또는 37도에서 30분) 방치합니다.°C), 현미경으로 마트리젤을 관찰합니다. 마트리젤은 잘 분산되어야 하며 "뭉쳐지지" 않아야 합니다.
9. 다른 시간에 플레이트를 사용하는 경우 플레이트 가장자리를 파라필름으로 감싸고 4에서 보관하십시오.°C 최대 2주 동안.

마트리겔 – BD/피셔, cat#CB-40230

DMEM/F12 – Life Technologies, 카탈로그 #11330-057

윌리엄 스탠포드 박사-2022

11. ES 또는 iPS 세포 해동(크라이오바이알 당)

1. 4°C에서 마트리겔 플레이트를 꺼내어 실온에서 1시간 동안 데우거나, 새로운 마트리겔 플레이트를 만듭니다(마트리겔 플레이트 준비 프로토콜 참조).
2. 15mL 팔콘 튜브에 mTeSR Plus 4mL를 넣고 따뜻하게 데웁니다.
3. 액체질소 탱크에서 세포를 꺼내고 37°C 욕조에서 작은 얼음 조각만 남을 때까지 돌립니다. 바이알은 1-2분 안에 해동됩니다. 이 단계는 빨리 해야 합니다.
4. 에탄올 셀 튜브와 팔콘 미디어 튜브를 후드에 놓습니다.
5. 1mL을 사용하세요 넓은 입 끝을 천천히 예열된 배지 4mL에 세포를 첨가합니다(세포 현탁액이 섞이지 않도록 주의하세요).
6. 130 rcf에서 5분간 회전시킵니다.
7. 상층액을 제거합니다.
8. 2mL의 PSC 배지를 추가하고 넓은 입구 팁을 사용하여 덩어리를 부드럽게 쪼개다. 6웰 플레이트의 한 웰에 배지를 옮기고 ROCK 저해제(Y27632, 최종 농도 10uM) 2uL를 첨가합니다. 마트리젤 코팅 웰(6웰 플레이트) 중 하나에 플레이트합니다.
9. 세포를 가볍게 흔들어 세포를 균등하게 분산시키고 저산소 배양기(5%O)에 넣습니다.₂, 10% 주식회사₂). 파종 후 24시간 동안 판을 흔들지 마십시오.

   메모: 덩어리가 과도하게 부서지거나 공격적인 피펫팅을 피하는 것이 매우 중요합니다. 이는 생존율을 상당히 감소시킬 수 있습니다. 세포는 접종 시 100-300개 크기의 덩어리로 남아 있어야 합니다. 부드럽게 진행하되, 세포가 해동되면 빠르게 작업하여 냉동 보호제와 접촉하는 시간을 최소화하십시오.

10. 24시간 후 배지를 제거하고 PSC 배지 2mL(6웰 플레이트의 경우 1mL, 12웰 플레이트의 경우 0.5mL)를 추가합니다. hESC/iPSC 프로토콜의 수확 및 관리를 참조하세요.

PSC 미디어

Stem Cell Technologies의 mTeSR Plus(cat# 5825). 보관에 대한 공급업체의 권장 사항을 따르세요.

ROCK 억제제 Y27632란 무엇입니까?

ROCK 저해제 Y27632는 Rho 관련 키나제 p160 ROCK의 선택적 저해제입니다. ROCK 저해제 Y27632로 치료하면 인간 배아줄기세포(hESC)와 인간 유도만능줄기세포(iPSC)의 해리 유도 세포사멸이 예방되어 hESC와 hiPSC의 계대배양 및 해동 중에 생존율이 증가하고 다능성이 유지됩니다. ROCK 저해제 Y27632는 또한 냉동보존 중에 줄기세포의 생존율을 높이는 것으로 나타났습니다. Rock 저해제 분취액은 빛과 반복적인 동결-해동 주기에 민감하다는 점에 유의하십시오. 공급업체의 권장 유통기한 내에 이 분취액을 사용해야 합니다.

윌리엄 스탠포드 박사-2022

12. hESC/iPSC 수확 및 관리

1. 세포를 해동한 다음 날 현미경으로 관찰하여 생존율을 확인합니다. 참고: 부착되지 않은 세포가 많이 관찰되는 것은 정상입니다. 일부 세포가 부착되어 있는 한, 3~7일 이내에 군집이 생길 수 있습니다.
2. 웰에서 배지를 제거하고 웰당 2mL(6웰의 경우 1mL, 12웰의 경우 1mL, 24웰 플레이트의 경우 0.5mL)의 신선하고 따뜻한 PSC 배지를 피펫으로 옮깁니다. 플레이트를 인큐베이터로 다시 넣습니다.
3. 세포는 60-70%가 합류할 때까지 영양을 공급받습니다(공급업체의 권장 사항을 따릅니다).
4. 2일차에 세포를 관찰하여 성장하고 있을 수 있는 분화된 세포를 제거해야 합니다.
5. 세포를 세척하려면 피킹 후드를 사용하고 피펫 팁으로 분화된 세포를 긁어냅니다.
6. 세포가 세척되면 위의 단계에 따라 배지를 교체합니다.

(hESC/iPSC 동결 또는 hESC/iPSC 전달 참조)

메모:

PSC 배지는 저산소 환경에서 더 효율적인 것으로 밝혀졌습니다. 또한 세포가 저산소 배양기에서 배양될 때 정상산소 배양기보다 분화가 덜 일어나는 것을 관찰했습니다. 마지막으로, 파종된 세포는 저산소 배양기를 사용할 때 생존율이 더 좋습니다.

정상산소: 37°씨, 21% 오₂, 5% 주식회사₂

저산소증: 37°씨, 5%O₂, 10% 주식회사₂

윌리엄 스탠포드 박사-2022

13. hESC/iPSC 통과

1. 6웰 마트리젤 코팅 플레이트에 PSC 배지 2mL을 넣고 따로 보관합니다.
2. 배양할 플레이트를 꺼내고 웰에서 배지를 제거한 후 1mL의 PBS(-/-)로 한 번 세척합니다.
3. EDTA 용액 1mL을 웰에 넣고 실온에서 3-4분간 방치합니다. 세포가 분리되기 시작할 수 있으므로 플레이트를 움직이지 마십시오.
4. EDTA 용액을 제거하고 1mL의 PSC 배지를 추가합니다. EDTA를 세포에 4분 이상 두지 마십시오. 세포가 들어올려질 수 있습니다.
5. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁어내고 PSC 배지가 들어 있는 플레이트의 6개 웰에 세포를 나눕니다. 콜로니 조각을 과도하게 쪼개지 않도록 하고, 부드럽게 긁어내도록 노력합니다. 세포를 큰 덩어리로 유지하도록 노력합니다. 필요한 경우 넓은 입 피펫 팁을 사용하여 덩어리를 쪼개십시오. 세포를 과도하게 쪼개면 세포 사망이나 계대 후 과도한 자발적 분화가 발생할 수 있습니다.
6. 37에서 배양°C 각 웰에 세포를 고르게 분배한 후(8자 모양 또는 L자 모양 흔들기). 통과 후 24시간 동안 플레이트 교란을 피하십시오.

메모: 세포를 긁어낸 후에는 가능한 한 빨리 새로운 플레이트로 옮겨야 합니다. 세포가 빠르게(5분 이내) 다시 부착되기 때문입니다.

EDTA를 세포에 4분 이상 두면 세포가 분리되기 시작할 수 있습니다. 이런 경우, 15mL 팔콘에 4mL PSC 배지를 넣고 세포를 수집하기만 하면 됩니다. 세포를 130 rcf에서 5분간 회전시킵니다. 펠릿을 1mL 배지로 재현탁시키고 6웰 마트리겔 코팅 플레이트(웰당 160uL)에 고르게 분배합니다.

EDTA 용액: 500uL의 0.5M EDTA(pH 8.0)를 500mL의 DPBS(-/-)에 첨가합니다. 0.9g의 NaCl을 첨가합니다. 용액을 여과하여 살균하고 최대 6개월 동안 4°C에서 보관합니다.

논문에서:

화학적으로 정의된 배양 조건에서 효소 없는 분리를 통한 인간 다능성 줄기 세포의 통과 및 집락 확장

자넷 비어스,¹ 다니엘 R. 굴브랜슨,^2,3 니콜 조지,⁴로렌 I. 시니스칼키,¹ 제프리 존스,^4,5 제임스 A. 톰슨,^2,3,6 그리고 궈카이 첸^1,2

14. hESC/iPSC 동결

1. Bio-Cool(속도 조절 냉동고)을 켜고 온도를 -7°C로 조정하세요.
2. 배양기에서 세포를 꺼내 현미경으로 밀집도와 형태를 관찰합니다.
3. 웰이 70% 합류 상태라면 기존 배지를 제거하고 PBS(-/-)로 한 번 세척한 다음 웰당 1 mL의 EDTA 용액(EDTA 용액 통과 참조)을 첨가합니다.
4. 실온에서 3~4분간 배양합니다.
5. EDTA 용액을 흡인하고 차가운 mFreSR 배지(cat#05855, Stem Cell Technologies) 1 mL를 첨가합니다.
6. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 부드럽게 들어올립니다. 세포를 가능한 한 큰 덩어리로 유지하고 위아래로 피펫팅하지 마십시오.
7. 넓은 입 끝을 사용하여 세포/mFreSR을 크라이오튜브로 옮깁니다. 8단계를 준비할 때까지 바이알을 얼음 위에 두십시오.
8. 튜브를 Bio-Cool에 넣고 10분 동안 배양합니다.
9. 액체질소를 구하세요.
10. 10분 후, 주걱을 액체 질소에 담그고 크라이오바이알의 측면을 약 10~30초 동안 만지거나 크라이오바이알 측면에 결정이 형성될 때까지 만져서 세포를 접종합니다.
11. "PROG" 버튼을 눌러 프로그램 1을 시작하고 버튼을 다시 눌러 프로그램을 진행하면 0.5°C/분의 속도가 표시되어야 합니다. 그런 다음 "RUN"을 누릅니다.
12. 온도가 -65°C에 도달하면 크라이오튜브를 액체 질소로 옮겨 보관할 수 있습니다.

대안

또 다른 옵션은 냉동 용기(Biocision-CoolCell)에 크라이오 튜브를 넣고 밤새 -80°C에서 보관하는 것입니다. 다음날 크라이오 튜브를 액체 질소(액상 또는 증기상)로 옮깁니다.

윌리엄 스탠포드 박사-2022