پاڼه غوره کړئ

هڅول شوی Pluripotent

سټیم سیلونه

 

1. د غیر ساینس پوه لپاره د iPSC پس منظر معلومات

د سټیم حجرې "نابالغ" حجرې دي چې تر اوسه یې د یو ډول حجرو جوړولو ته ژمن ندي. دوی نرم دي ځکه چې دوی په بدن کې د ډیری مختلف ډوله بالغ حجرو رامینځته کولو وړتیا لري ، لکه هغه حجرې چې زړه یا د وینې رګونه جوړوي ، او نور نسجونه او غړي. په 2007 کې، څیړونکو په لابراتوار کې د بالغ بالغ حجرو د بیا پروګرام کولو له لارې د سټیم حجرو جوړولو لپاره یوه ستراتیژي وموندله چې موږ عموما د څیړنې موخو لپاره وده کوو.1, 2 . دا په مصنوعي ډول جوړ شوي سټیم حجرې د Induced Pluripotent Stem Cells ("iPSCs" په نوم یادیږي. د پروجیریا ساحې لپاره ، دا یو لوی پرمختګ دی. د لومړي ځل لپاره ، ساینس پوهان اوس کولی شي د پروجیریا سټیم حجرې رامینځته کړي او پدې اړه پوښتنې وکړي چې څنګه په پروجیریا کې سټیم حجرې فعالیت او وده کوي. مخکې د انسان د پروجیریا سټیم حجرو کومه سرچینه نه وه ، او له همدې امله د پروجیریا سټیم حجرې د پروجیریا پرته د خلکو د سټیم حجرو سره پرتله کولو څرنګوالي په اړه معلومات باطل و. سربیره پردې ، ساینس پوهان کولی شي د پروجیریا سټیم حجرې بیا برنامه کړي ترڅو د لومړي ځل لپاره د پروجیریا د وینې رګونه ، د زړه حجرې او نور حجرې ډولونه رامینځته کړي. تر دې دمه ، د انسان پروجیریا زړه یا د وینې رګونو حجرو سرچینه نه وه.  موږ اوس کولی شو کیلي وغواړو د زړه ناروغۍ په اړه پوښتنې چې په پروجیریا کې د زړه حملې او سټروک څخه د لومړني مړینې لامل کیږي. موږ کولی شو دا موندنې په عام نفوس کې د زړه ناروغۍ او عمر سره پرتله کړو او د دې په اړه نور څه ومومئ چې زموږ په ټولو کې عمر اغیزه کوي. دمخه د پروجیریا سټیم حجرو په کارولو سره ډیری عالي مطالعات خپاره شوي.3-5  د پروجیریا ریسرچ فاؤنڈیشن کې زموږ هدف د دې ارزښتناکه وسیلې په کارولو سره ډیری نور کشفونه اسانه کول دي. د سټیم حجرو پرائمر لپاره، مهرباني وکړئ د متحده ایاالتو حکومت ویب پاڼه وګورئ: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

 

    1. تاکاهاشي K، Tanabe K، Ohnuki M، Narita M، Ichisaka T، Tomoda K، Yamanaka S. د ټاکل شوي فکتورونو له مخې د بالغ انسان فایبروبلاستونو څخه د pluripotent سټیم حجرو داخلول. حجره. 2007;131:861-872.
    2. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin, II, Thomson JA. هڅول شوي pluripotent سټیم سیل لینونه د انسان سوماتیک حجرو څخه اخیستل شوي. ساینس. 2007;318:1917-1920.
    3. Liu GH، Barkho BZ، Ruiz S، Diep D، Qu J، Yang SL، Panopoulos AD، Suzuki K، Kurian L، Walsh C، Thompson J، Boue S، Fung HL، Sancho-Martinez I، Zhang K، Yates J، دریم، Izpisua Belmonte JC. د هچینسن - ګیلفورډ پروجیریا سنډروم څخه د iPSCs سره د وخت دمخه عمر تکرار کول. طبیعت. 2011;472:221-225.
    4. Misteli T. د عمرونو لپاره د HGPS څخه اخیستل شوي iPSCs. د حجرو سټیم سیل. 2011;8:4-6.

2. د پروجیریا ریسرچ فاؤنڈیشن لخوا د هڅول شوي pluripotent سټیم سیل (iPSC) تولید او توزیع هدف

د پروجیریا ریسرچ فاؤنڈیشن ماموریت د هچینسن - ګیلفورډ پروجیریا سنډروم او د دې عمر پورې اړوند اختلالاتو درملنې او درملنه کشف کول دي. په 2009 کې، PRF د کاناډا د ټورنټو په پوهنتون کې د ساینس پوهانو د متخصص ټیم سره همکاري وکړه، د ویلیم سټینفورډ، پی ایچ ډی تر لارښوونې لاندې، د لوړ کیفیت پروجیریا iPSCs تولید لپاره. ډاکټر سټینفورډ د انټیګریټیو سټیم سیل بیولوژي کې د کاناډا د څیړنې رییس دی. تر 2011 پورې، PRF د کاناډا په اوټاوا پوهنتون کې د ډاکټر سټینفورډ سره همکارۍ ته دوام ورکوي چیرې چې هغه د سیلولر او مالیکولر درملو پروفیسور دی، د طب پوهنځي، او د اوټاوا روغتون د څیړنې انسټیټیوټ د سټیم سیل څیړنې لپاره د سپورت مرکز کې لوړ پوهه پوه دی.

زموږ هدف دا دی چې دا ارزښتناکه وسیله په ټوله نړۍ کې څیړونکو ته چمتو کړو. دا نوې څیړنې وسیله به په پروجیریا کې د نوي او نوښت څیړنې رامینځته کولو لپاره وکارول شي ، په بیله بیا د زړه ناروغۍ او عمر سره د هغې اړیکې.  

3. د هچینسن-ګیلفورډ پروجیریا سنډروم د هڅونې-پلوریپوټینټ سټیم سیلونو تولید (iPSCs)

Induced-Pluripotent Stem Cells (iPSCs) د څلورو انساني فکتورونو، Oct4، Sox2، Klf4، او c-Myc په فایبروبلاسټونو کې د VSVG-pseudotyped retroviral لیږد په کارولو سره اخیستل شوي. د iPSC نوښتونه د موږک جنین فایبروبلاستونو (MEFs) څخه اخیستل شوي. کارول شوی طرزالعمل اساسا لکه څنګه چې مخکې تشریح شوی و مګر د EOS راپور ورکوونکي کارولو پرته (د فطرت پروتوکول 4: 1828-1844، 2009). 

4. د کیفیت کنټرول: تایید او ځانګړتیا

هغه لینونه چې اوس مهال شتون لري د تایید کولو څو مرحلې تیرې شوي (د ډاونلوډ وړ PDFs لاندې وګورئ):

 

    1. د هرې کرښې لپاره د مایکوپلاسما ازموینه: د ډاکټر سټینفورډ لابراتوار د هرې حجرې کرښې لپاره د PCR په واسطه د مایکوپلاسما تحلیل ترسره کړی. برسېره پردې، د توسع کولو وروسته او د لیږد حجرو څخه مخکې، لینونه به د مایکوپلاسما لپاره بیا ازموینه وشي.
    2. د pluripotency نښه کونکي Tra-1-60، Tra-1-81، او SSEA4 لپاره معافیت.
    3. د الکلین فاسفیتس داغ د pluripotency د شاخص په توګه
    4. د جنین د بدن جوړښت او د دریو میکرو پرتونو نښه کونکو لپاره وروسته معافیت. ازمول شوي مارکرونه βIII-Tubulin (Ectoderm)، Smooth-Muscle Actin (Mesoderm)، او Gata4 یا AFP (Endoderm) وو.
    5. د کیریوټایپ تحلیل.
    6. په جلا جلا حجرو کې د لامین A بیا څرګندول
    7. Teratoma assays

په پروسه کې اضافي تایید:
ځینې لینونه د teratoma Assess بشپړ کړي لکه څنګه چې په مالتړ معلوماتو کې ښودل شوي. د نورو ټولو لینونو لپاره، د teratoma Assess په پروسه کې دي او وضعیت به تازه شي کله چې دا ارزونه بشپړ شي.

5. اصلي پیل شوي مواد چې له هغې څخه دا iPS حجرې اخیستل شوي

iPSCs د PRF سیل او نسج بانک د غیر بدل شوي فایبروبلاسټ حجرو لاینونو څخه اخیستل شوي.

د ټولو iPS لاینونو لپاره د لیږد میتود کارول شوی Retrovirus MKOS و.

د iPSC لاین IDبدلونجندر او د بسپنه عمرد اصلي حجرو ډول دلته کلیک وکړئ.د معلوماتو ملاتړ کول
HGADFN003 iPS 1B LMNAExon 11,
1824 C>T
نارینه 2 کلن 0 میاشت د پوستکي فایبروبلاستونه
HGADFN003
003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C LMNA Exon 11,
1824 C>T
نارینه 2 کلن 0 میاشت د پوستکي فایبروبلاستونه
HGADFN003
003 iPS1C
HGDFN003
iPS 1D
LMNA Exon 11,
1824 C>T
نارینه 2 کلن 0 میاشت د پوستکي فایبروبلاستونه
HGADFN003
003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J LMNA Exon 11، 1824 C>Tنارینه ۸ کلن ۵ میاشتیDermal Fibroblasts HGADFN167167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q LMNA Exon 11، 1824 C>Tنارینه ۸ کلن ۵ میاشتیDermal Fibroblasts HGADFN167167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B د HGADFN167 مور (بې اغیزې)ښځه 37 کلن 10 میاشتد پوستکي فایبروبلاستونه
HGMDFN090
090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C د HGADFN167 مور (بې اغیزې)ښځه 37 کلن 10 میاشتد پوستکي فایبروبلاستونه
HGMDFN090
090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2د HGADFN167 پلار (بې اغیزې)40 کلن نارینه
۵ میاشت
Dermal Fibroblasts HGFDFN168168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1Pد HGADFN167 پلار (بې اغیزې)40 کلن نارینه
۵ میاشت
د پوستکي فایبروبلاستونه
HGFDFN168
168 iPS1P

6. د راتلونکي iPSC تازه معلوماتو او نوي سیل لاینونو لپاره زموږ د بریښنالیک لیست سره یوځای شئ

موږ د iPSC لاینونو تولید ته دوام ورکوو. که تاسو غواړئ په PRF سیل او نسج بانک کې د iPSCs په اړه دوره ای تازه معلومات ولرئ، مهرباني وکړئ زموږ د بریښنالیک لیست سره یوځای شئ په کلیک کولو سره دلته

7. پوښتنې؟

مهرباني وکړئ د لیسلي ګورډن، MD، PhD، طبي رییس سره اړیکه ونیسئ، د کومې پوښتنې یا اړتیا سره، په دې کې lgordon@progeriaresearch.org یا 978-535-2594

8. د iPS سیل لینونو ترتیب کول

په 2014 کې، PRF زموږ په MTA کې د هیڅ بدلون پالیسي جوړه کړه. دا د 14 هیوادونو په ادارو کې د 70 څیړنیزو ټیمونو سره د 12 کلونو قراردادي ترتیباتو پایله ده. PRF او د هغې وکیل هغه مسلې په پام کې نیولي چې په دې موده کې راپورته شوي او د موافقتنامې مطابق یې تدوین کړي، په پایله کې هغه څه چې موږ احساس کوو عادلانه او معقول شرایط دي.

د متحده ایالاتو د فدرالي حکومت ادارو یا پوښتنو لپاره، مهرباني وکړئ له وینډي نوریس سره اړیکه ونیسئ: wnorris@brownhealth.org یا 401-274-1122 x 48063.

1 ګام: د غوښتنلیک او موادو لیږد تړون بشپړ کړئ

د غیر دولتي موسسو لپاره غوښتنلیک او تړون

د غیر دولتي بنسټونو لپاره د موادو د لیږد تړون

2 ګام: بشپړ شوی غوښتنلیک او د موادو لیږد تړون وینډي نوریس ته بیرته راستانه کړئ wnorris@brownhealth.org. یوځل چې تصویب شو، تاسو به یو بریښنالیک ترلاسه کړئ چې ستاسو امر او د لیږد اټکل شوي نیټه تاییدوي. 

درېیم ګام: د ډاکټر سټینفورډ لابراتوار اوس مهال په منجمد کریوویالونو کې لینونه توزیع کوي. د هغه لابراتوار به تاسو ته بریښنالیک درکړي کله چې کلتور لیږدول شوی وي ، د بار وړلو او تعقیب معلوماتو سره. بې تجربه څیړونکو ته لارښوونه کیږي چې په ځانګړي کورسونو کې روزنه ترلاسه کړي چې د انسان جنین سټیم سیل / iPSCs کار لپاره اړین دي.

د اوټاوا روغتون څیړنیز انسټیټیوټ کې د انسان پلوریپوټینټ سټیم سیل اسانتیا (د ډاکټر سټینفورډ لخوا لارښود شوی) د پروجیریا iPSC حجرو لاینونو ته ځانګړي د iPSC کلتور تخنیکونو اساساتو په اړه یو له بل سره مجازی روزنه وړاندې کوي. د روزنې اختیارونه او بڼه د ساینس پوهانو د تجربې کچې پورې اړه لري انعطاف وړ دي.  د نورو معلوماتو لپاره، مهرباني وکړئ بریښنالیک hpscf@ohri.ca.

4 ګام: د اوټاوا پوهنتون به تاسو ته مستقیم د هر iPSC لاین او د کوریر لګښتونو لپاره رسید درکړي ، که کوم وي.

9. HGPS او کنټرول iPS سیل کلتور میډیا چمتو کول

iPSC او ESCs باید د سټیم سیل ټیکنالوژۍ (cat# 5825) څخه mTeSR Plus سره تغذیه شي. مهرباني وکړئ د ذخیره کولو لپاره د عرضه کونکي سپارښتنې تعقیب کړئ.

10. د میټریګل پلیټونو چمتو کول

نوټ: ټول هغه مرحلې چې میټریګل پکې شامل وي باید ژر تر ژره ترسره شي او د امکان تر حده سړه پاتې شي.

  1. د میټریګل بوتل په 4 کې وخورئ°C. د پروټین غلظت موندلو لپاره په دې لاټ کې د تحلیل سند وګورئ.
  2. په کافي اندازه سړه DMEM/F12 میډیا په حل شوي میټریګل کې اضافه کړئ ترڅو د 5mg/mL وروستي غلظت ته ورسیږي.
  3. د چمتو شوي میټریګیل 1 ملی لیتر الیکوټس د 15 ملی لیتر فالکون ټیوبونو کې له 2 مرحلې څخه مخکې یخ کړئ.
  4. ټول الکوټس په -20 کې منجمد او ذخیره کړئ°ج.
  5. د میټریګل پلیټونو جوړولو لپاره ، د میټریګل (1 ملی لیتر) یو الکوت له -20 څخه لرې کړئ°C او 10 ملی لیتر سړه DMEM/F12 اضافه کړئ. ښه مخلوط کړئ تر هغه چې ګولۍ وخورئ (پرته له دې چې بلبلونه رامینځته کړي، او تل محلول سړه وساتئ).
  6. یو 50 ملی لیتر ټیوب ته انتقال کړئ، بیا 20 ملی لیتر سړه DMEM/F12 اضافه کړئ (1mL matrigel aliquot د DMEM/F12 په 30mL کې مینځل کیږي)، ښه مخلوط کړئ.
  7. پلیټ (1mL/څاه د 6 څاه پلیټ لپاره، 0.5mL/څاه د 12 څاه پلیټ لپاره، 0.25mL/څاه د 24 څاه پلیټ لپاره). ډاډ ترلاسه کړئ چې محلول په نرمۍ سره د پلیټ په وهلو سره د سطحې ټوله ساحه پوښي. هیڅ پاتې میټریګل بیا کنګل مه کوئ.
  8. که پلیټ سمدستي کاروئ، پریږدئ چې پلیټ د خونې په حرارت درجه کې د 1 ساعت (یا 30 دقیقې په 37 کې) کېږدي°ج) د مایکروسکوپ لاندې میټریګل وګورئ. میټریګیل باید په ښه توګه توزیع شي او "ګډون" نه وي.
  9. که چیرې په بل وخت کې پلیټونه وکاروئ، د پلیټ څنډه د پارفیلم سره وتړئ او په 4 کې ذخیره کړئ°C تر 2 اونیو پورې.

میټریګل - BD/فشر، cat#CB-40230

DMEM/F12 - د ژوند ټیکنالوژي، cat#11330-057

ډاکټر ویلیم سټینفورډ - 2022

11. د ES یا iPS حجرو پړسوب (په هر کریو ویال کې)

  1. د میټریګیل پلیټ له 4 درجې سانتي ګراد څخه واخلئ او د خونې په حرارت کې د یو ساعت لپاره ګرم کړئ ، یا تازه میټریګل پلیټ جوړ کړئ (د میټریګل پلیټ پروتوکول چمتو کول وګورئ).
  2. په 15mL فالکن ټیوب کې 4mL mTeSR Plus ګرم کړئ.
  3. د مایع نایټروجن ټانک څخه حجرې لرې کړئ او په 37 درجې سانتي مترو کې حمام کې وګرځئ تر څو چې یوازې د یخ یوه کوچنۍ ټوټه پاتې وي. شیش باید په 1-2 دقیقو کې وچ شي. دا ګام باید په چټکۍ سره ترسره شي.
  4. د ایتانول سیل ټیوب او فالکن میډیا ټیوب او په هود کې ځای په ځای کیږي.
  5. 1 ملی لیتر وکاروئ د خولې پراخه څنډه ورو ورو د مخکینۍ تودوخې میډیا 4mL ته حجرې اضافه کړئ (د حجرو تعلیق مخلوط کولو څخه ډډه وکړئ).
  6. د 5 دقیقو لپاره په 130 rcf کې وخورئ.
  7. سپرناټینټ لرې کړئ.
  8. د PSC میډیا 2mL اضافه کړئ، او د پراخې خولې سره په نرمۍ سره ټوټې ټوټې کړئ. د 6 څاه پلیټ څخه یوې څاه ته میډیا انتقال کړئ 2uL ROCK inhibitor اضافه کړئ (Y27632، د 10uM وروستی غلظت). په یو میټریګیل ښه پوښل شوی (د 6 څاه پلیټ څخه).
  9. راک حجرې په نرمۍ سره حجرې په مساوي ډول توزیع کوي او په هایپوکسیک انکیوبټر کې ځای په ځای کوي (5%O2، 10% CO2). د کښت کولو وروسته د 24 ساعتونو لپاره د پلیټ ګډوډۍ څخه مخنیوی وکړئ.

    یادونه: دا ډیره مهمه ده چې د ډیری کلمپونو ماتولو یا تیریدونکي پایپټینګ څخه مخنیوی وشي. دا کولی شي د پام وړ د بقا کچه کمه کړي. حجرې باید د تخم د کرلو په وخت کې د 100-300 حجرو په لویو برخو کې پاتې شي. پداسې حال کې چې نرم وي، هڅه وکړئ کله چې حجرې پړسیدلي وي نو ژر تر ژره کار وکړئ ترڅو هغه وخت کم کړي چې دوی د کریوپروټیکټینټ سره تماس کې وي.

  10. د 24 ساعتونو وروسته میډیا لرې کړئ او د PSC میډیا 2mL اضافه کړئ (د 6 څاه لپاره، 1mL د 12 څاه لپاره او 0.5mL د 24 څاه پلیټ لپاره). د hESC/iPSC پروتوکول لپاره د حاصلاتو راټولول او پاملرنه وګورئ.

    د PSC رسنۍ

    mTeSR Plus د سټیم سیل ټیکنالوژۍ (cat# 5825) څخه. مهرباني وکړئ د ذخیره کولو لپاره د عرضه کونکي سپارښتنې تعقیب کړئ.

    د ROCK مخنیوی Y27632 څه شی دی؟

    ROCK Inhibitor Y27632 د Rho پورې تړلي kinase p160 ROCK انتخابی مخنیوی کونکی دی. د ROCK Inhibitor Y27632 سره درملنه د انسان جنین سټیم حجرو (hESC) او د انسان هڅول شوي pluripotent سټیم حجرو (iPSC) د جلا کیدو هڅول شوي اپوپټوسس مخه نیسي ، د ژوندي پاتې کیدو کچه لوړوي او د hESCs او HIPSCs د فرعي کښت او غوړیدو پرمهال د pluripotency ساتل. د ROCK Inhibitor Y27632 هم ښودل شوي چې د کریوپریزرویشن په جریان کې د سټیم حجرو د بقا کچه لوړه کړي. په یاد ولرئ چې د راک مخنیوی کونکي الکوټس د رڼا او تکراري منجمد پړسوب سایکلونو سره حساس دي. ډاډ ترلاسه کړئ چې د عرضه کونکي وړاندیز شوي شیلف ژوند کې د دې الکوټس څخه کار واخلئ.

    ډاکټر ویلیم سټینفورډ - 2022

    12. د hESC/iPSC لپاره د حاصلاتو راټولول او ساتنه

    1. یوه ورځ وروسته له دې چې حجرې پړسیدلې وې د مایکروسکوپ لاندې یې وګورئ ترڅو د بقا کچه معلومه کړي. نوټ: دا عادي خبره ده چې د ډیرو غیر تړلو حجرو څارنه وکړئ. تر هغه چې ځینې حجرې وصل وي، نو کالونیز کولی شي د 3 - 7 ورځو په اوږدو کې له دوی څخه رامینځته شي.
    2. له څاګانو څخه میډیا لرې کړئ او په هر څاه کې د تازه او ګرمو PSC میډیا 2 ملی لیتر (د 6 څاګانو لپاره ، 1 ملی لیتر د 12 څاګانو لپاره او 0.5 ملی لیتر د 24 څاګانو لپاره) لرې کړئ. پلیټ انکیوبیټر ته راستانه کړئ.
    3. حجرې تر 60-70% پورې تغذیه کیږي (د عرضه کونکي سپارښتنې تعقیب کړئ).
    4. د 2 ورځې پورې، حجرې باید مشاهده شي او د هر ډول توپیر لرونکي حجرو څخه پاک شي چې ممکن وده وکړي.
    5. د حجرو پاکولو لپاره، د غوره کولو هود وکاروئ او د پایپټ ټیپ سره مختلف حجرې لرې کړئ.
    6. کله چې حجرې پاکې شي، میډیا بدل کړئ لکه څنګه چې په پورته ګامونو کې ترسره شوي.

    (د hESC/iPSC کنګل کول یا د hESC/iPSC پاس کول وګورئ)

    یادونه:

    د PSC میډیا ټاکل شوې وه چې په هایپوکسیک چاپیریال کې ډیر اغیزمن وي. موږ دا هم لیدلي چې لږ توپیر واقع کیږي کله چې حجرې په هایپوکسیک انکیوبیټرونو کې د نورموکسیک په پرتله وده کوي. په نهایت کې ، تخم شوي حجرې د هایپوکسیک انکیوبټر کارولو په وخت کې د بقا غوره نرخ لري.

    نورموکسیک: ۳۷°سي، 21% O2، 5% CO2

    هایپوکسیک: ۳۷°C، 5%O2، 10% CO2

    ډاکټر ویلیم سټینفورډ - 2022

    13. د HESC/iPSC پاس کول

    1. 2 ملی لیتر PSC میډیا په 6 ښه میټریګل لیپت شوي پلیټ کې اضافه کړئ او یو طرف کېږدئ.
    2. د تېرېدو لپاره پلیټ واخلئ او رسنۍ له څاه څخه لرې کړئ او یو ځل د 1 ملی لیتر PBS (-/-) سره ومینځئ.
    3. په څاه کې د EDTA محلول 1 ملی لیتر اضافه کړئ او د خونې په حرارت کې د 3-4 دقیقو لپاره پریږدئ. پلیټ شاوخوا مه حرکت کوئ ځکه چې حجرې کولی شي جلا کول پیل کړي.
    4. د EDTA حل لرې کړئ او د PSC میډیا 1mL اضافه کړئ. EDTA د 4 دقیقو څخه ډیر په حجرو کې مه پریږدئ ځکه چې دا به د حجرو د پورته کیدو لامل شي.
    5. حجرې د سیل سکریپر په کارولو سره سکریپ کړئ او ستاسو د پلیټ د 6 څاګانو په مینځ کې حجرې تقسیم کړئ چې PSC میډیا لري. د کالونی ټوټو د ډیر ماتولو څخه ډډه وکړئ، او هڅه وکړئ چې د سکریپ کولو سره نرم وي. هڅه وکړئ چې حجرې په لویو برخو کې وساتئ. د اړتیا په صورت کې د کلمپونو د ماتولو لپاره د خولې پراخه پیپټ ټیپ وکاروئ. د حجرو ډیر ماتیدل ممکن د حجرو مړینه یا د تیریدو وروسته ډیر ناڅاپي توپیر لامل شي.
    6. په 37 کلنۍ کې تنفس کړئ°C وروسته له دې چې په هر څاه کې حجرې په مساوي ډول توزیع کړي (د 8 شکل یا د L شکل څپېدنه). د تیریدو وروسته د 24 ساعتونو لپاره د پلیټ ګډوډۍ څخه مخنیوی وکړئ.

    نوټ: یوځل چې حجرې سکریپ شوې وي نو تاسو غواړئ ژر تر ژره نوي پلیټ ته یې واستوئ ځکه چې حجرې به په چټکۍ سره بیا وصل شي (په 5 دقیقو کې).

    که چیرې EDTA د 4 دقیقو څخه ډیر په حجرو کې پاتې شي، حجرې کولی شي جلا کول پیل کړي. که دا پیښ شي، په ساده ډول حجرې په 15mL falcon کې د 4mL PSC میډیا سره راټول کړئ. حجرې د 5 دقیقو لپاره په 130 rcf کې وخورئ. ګولۍ د 1mL میډیا سره بیا ځای پرځای کړئ او په مساوي ډول د 6 څاه میټریګل لیپت شوي پلیټ (په هر څاه کې 160uL) سره وویشئ.

    د EDTA حل: 500uL د 0.5M EDTA (pH 8.0) په 500mL DPBS (-/-) کې اضافه کړئ. 0.9 ګرامه NaCl اضافه کړئ. د تعقیم کولو لپاره محلول فلټر کړئ او تر 6 میاشتو پورې یې په 4 ° C کې ذخیره کړئ.

    له کاغذ څخه:

    د کیمیاوي تعریف شوي کلتور شرایطو کې د انزایم څخه پاک تحلیل په واسطه د انسان pluripotent سټیم حجرو تیریدل او د کالونی پراختیا

    جینټ بیر,1 ډینیل آر ګلبرانسن,2,3 نیکول جورج,4لارین آی سینیسکالچي,1 جیفري جونز,4,5 جیمز اې تامسن,2,3,6 او ګووکای چن1,2

    14. د hESC/iPSC کنګل کول

    1. بایو کول (کنټرول شوي نرخ فریزر) چالان کړئ او د تودوخې درجه -7 درجې ته تنظیم کړئ.
    2. د انکیوبټر څخه حجرې لرې کړئ او د مایکروسکوپ لاندې انفلاسیون او مورفولوژي وګورئ.
    3. که چیرې څاه 70% سره مل وي، زاړه میډیا لرې کړئ او یو ځل د PBS(-/-) سره ومینځئ بیا په هر څاه کې 1 ملی لیتر EDTA محلول اضافه کړئ (د EDTA محلول سره تیریدل وګورئ).
    4. د خونې په حرارت کې د 3-4 دقیقو لپاره مینځل.
    5. د EDTA محلول جذب کړئ او 1 ملی لیتر سړه mFreSR میډیا اضافه کړئ (cat#05855، سټیم سیل ټیکنالوژي).
    6. حجرې په نرمۍ سره پورته کولو لپاره د حجرو سکریپر وکاروئ. حجرې د امکان تر حده په لویو ټوټو کې وساتئ او د پایپ پورته کولو څخه مخنیوی وکړئ.
    7. حجرې/mFreSR د پراخې خولې په کارولو سره کریوټیوب ته انتقال کړئ. شیشې په یخ کې وساتئ تر هغه چې د 8 مرحلې لپاره چمتو وي.
    8. ټیوبونه په بایو کول کې ځای په ځای کړئ او د 10 دقیقو لپاره یې وینځئ.
    9. مایع نایټروجن ترلاسه کړئ.
    10. د 10 دقیقو وروسته، حجرې تخمونه د سپاتولا په مایع نایټروجن کې ډوب کړئ او د نږدې 10-30 ثانیو لپاره د کریو ویال اړخ ته لمس کړئ یا تر هغه چې تاسو د کریو شیش په اړخ کې کرسټال بڼه وګورئ.
    11. پروګرام 1 د "PROG" تڼۍ په فشارولو سره پیل کړئ او بیا د تڼۍ په فشارولو سره پروګرام ته لاړ شئ او تاسو باید د 0.5 درجې C/min نرخ وګورئ. بیا "RUN" فشار ورکړئ.
    12. کله چې د تودوخې درجه -65 سانتي ګراد ته ورسیږي د کریو ټیوبونه لیږدول کیدی شي او په مایع نایټروجن کې زیرمه شي.

    بدیلونه

    بله چاره دا ده چې کریو ټیوبونه په کنګل شوي کانټینر (Biocision-CoolCell) کې ځای په ځای کړئ او د شپې په -80 ° C کې ذخیره کړئ. کریو ټیوبونه په بله ورځ مایع نایتروجن (مایع یا بخار مرحله) ته انتقال کړئ.

    ډاکټر ویلیم سټینفورډ - 2022

    psPashto