د لیمفوبلاستونو د کرلو پروتوکول

د ودې منځنۍ کچه

RPMI 1640 – ترمو فشر # 11875
۱۵۱TP۳T د جنین د غواګانو سیرم (FBS) – ترمو فشر ۱TP۵T۱۰۴۳۷-۰۲۸
۱۱TP۳T (۱X) پنیسیلین-سټریپټومایسین (اختیاري) – ترمو فشر ۱TP۵T۱۵۱۴۰-۱۲۲

عمومي یادښتونه

• د ودې منځنی باید تل په انکیوبیټر کې د 37 درجو سانتی ګراد، 5% CO کې متوازن وي.₂ د کارولو دمخه د 30 دقیقو لپاره
• تل د هوا بندو خولیو سره بوتلونه وکاروئ
• تل فلاسک په مستقیم حالت کې واچوئ
• په T25 فلاسک کې باید له 20 ملی لیتر څخه زیات ونه کارول شي

د کنګل شویو حجرو غوړول

کنګل شوي حجرات به په وچه یخ کې په 1 ملی لیتر الکوټس کې ترلاسه شي. حجرات د حجرو د کلتور لپاره تر هغه وخته پورې منجمد وساتئ چې د اوبو سره نه وي یا که سمدلاسه کلتورونه پیل نه کړئ نو د مایع نایتروجن ذخیره کې ځای په ځای کړئ. په هرصورت، دا سپارښتنه کیږي چې که تاسو غواړئ حجرات د وروسته کارونې لپاره ذخیره کړئ، تازه ذخیره کړئ او ډیری امپولونه کنګل کړئ. حجرات په 45% RPMI-1640، 50% FBS، او 5% DMSO (د نسجونو کلتور درجې) کې کریوپریزر شوي دي.

1. 1. د RPMI-1640، 15% جنین غواګانو سیرم (FBS)، ± انټي بیوټیکونو 10 ملی لیتره په T-25 فلاسک کې د هوا بند شوي کیپ سره ځای په ځای کړئ.
   2. اجازه ورکړئ چې رسنۍ د 5% CO سره په 37 درجو سانتی ګراد رطوبت لرونکي انکیوبیټر کې متوازن شي.₂ د ۳۰ دقیقو لپاره په هوا کې وساتئ. فلاسکونه باید په مستقیم حالت کې کیښودل شي.
   3. د کنګل شویو حجرو هر امپول یا بوتل د ۳۷ درجو سانتي ګراد په اوبو حمام یا د ګرمو اوبو په یوه لوښي کې، یو په یو یې یو غوړ کړئ.
   4. د امپول یا وایل بهرنۍ برخه په چټکۍ سره د 70% ایتانول سره پاکه کړئ. که چیرې حجرې په شیشې امپول کې وي، نو امپول په احتیاط سره مات کړئ ترڅو ډاډ ترلاسه کړئ چې ګوتې د مات شوي شیشې څخه خوندي کړئ.
   5. ۱ ملی لیتر کنګل شوي حجرات د تعقیم پایپټ په واسطه لرې کړئ او په T-25 فلاسک کې د ۱۰ ملی لیتر میډیم سره ځای په ځای کړئ. د هر حجرو کرښې پیژندلو لپاره په روښانه ډول فلاسک لیبل کړئ.
   6. فلاسک په ۳۷ درجو سانتي ګراد رطوبت لرونکي انکیوبیټر کې د ۵۱TP۳T CO سره ځای په ځای کړئ.₂ په هوا کې. فلاسکونه باید په مستقیم موقعیت کې کیښودل شي.
   7. د ۲۴ ساعتونو وروسته، د بوتل له پورته څخه ۵ ملی لیتره منځنی مواد لرې کړئ پرته له دې چې د بوتل په ښکته برخه کې ځای پر ځای شوي لیمفوسایټس ته زیان ورسوي او د ۵ ملی لیتره مخکې ګرم شوي منځنی موادو سره یې ځای په ځای کړئ.
   8. د لیمفوبلاسټ حجرو کلتور پروتوکول سره پرمخ لاړشئ.

د لیمفوبلاست کلتور

1. 1. د ویلې کېدو څخه درې یا څلور ورځې وروسته، حجرات وشمېرئ. حجرات نه تړلي او په ټوټو کې وده کوي. ټوټو ته په نرمۍ سره پایپټینګ وکړئ.
   2. حجرې وشمېرئ.
   3. په مثالي توګه، د حجرو غلظت باید له 2 x 10 څخه زیات نه وي⁶ حجرات/ملی لیتر.
   4. د حجرو غلظت پورې اړه لري، حجرې تقسیم کړئ یا کنګل کړئ.
   5. د ۵-۶ ملی لیتر متوازن ودې منځني په اضافه کولو سره بیا تغذیه کړئ.
   6. نوي فصلونه په لږ تر لږه ۲ x ۱۰ کې تخم کړئ⁵ حجرات/ملی لیتر.
   7. حجرې باید په نږدې 5 x 10 کې کنګل شي⁶ حجرات/ملی لیتر. د حجرو د کنګل کولو پروتوکول تعقیب کړئ.

د لیمفوبلاستونو کنګل کول

1. 1. حجرې باید په نږدې 5 x 10 کې کنګل شي⁶ حجرات/ملی لیتر.
   2. د حجرو مناسب حجم ۱۵ یا ۵۰ ملی لیتر مخروطي ټیوب ته انتقال کړئ.
   3. سنټرفیوج په 4 درجو سانتی ګراد کې په 100 xg د 10 دقیقو لپاره.
   4. منځنی لرې کړئ او د سړې یخ وهلو منځنی په مناسب حجم کې یې بیا ځړوئ.
   5. د هر یو ۱ ملی لیتر حجرو کرایوویل ته انتقال کړئ.
   6. کرایوویلونه د یخولو په خونه کې ځای په ځای کړئ او خونه یې د شپې لپاره په -۸۰ درجو سانتي ګراد فریزر کې وساتئ.
   7. بله ورځ کرایوویلونه مایع نایتروجن ته انتقال کړئ.

وینډي نوریس