Tripsina

Tripsina EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)

Solução salina balanceada de Hank

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) cloreto de cálcio, (-) cloreto de magnésio, (-) sulfato de magnésio)

DMSO para Congelamento

DMSO de grau de cultura celular

As células chegarão congeladas em gelo seco em uma concentração de aproximadamente 5 x 10⁵células/frasco

Protocolo para descongelamento de fibroblastos

1. Descongele as células rapidamente em banho-maria a 37°C.
2. Limpe a parte externa do frasco com etanol 70%.
3. Transfira as células descongeladas para um frasco T25 contendo 5 ml de meio de crescimento sem puromicina.
4. Coloque o frasco na incubadora a 37°C durante a noite.
5. No dia seguinte, observe no microscópio para garantir que as células estejam aderidas.
6. Remova o meio e substitua por um novo meio de crescimento.

Subcultura de linhas celulares PRF

1) Quando as células estiverem estabelecidas e crescendo, comece a usar meios contendo 0,75 μg/ml de puromicina. Continue a manter as células em meios contendo 0,75 μg/ml de puromicina.

2) As células devem ser divididas quando confluentes.

3) Para dividir células (os volumes fornecidos pressupõem que as células estejam em um T25):

A. Usando técnica estéril, remova o meio e lave o frasco com 2-3 ml de HBSS estéril. Remova e descarte o HBSS.

B. Adicione 1 ml de tripsina e incubar por 2-3 minutos. As células devem ser verificadas sob um microscópio invertido para determinar se elas começaram a se arredondar, levantar e flutuar. Se as células não se destacarem após 3 minutos, você pode incubar por mais 1-2 minutos

C. Aperte a tampa e incline suavemente o frasco de um lado para o outro para desalojar todas as células. O frasco pode ser batido levemente na lateral para soltar as células, se necessário.

D. Adicione 4 ml de novo meio ao frasco assim que as células estiverem flutuando para inativar a tripsina. Enxágue as laterais do frasco várias vezes com o novo meio para lavar todas as células do plástico e para dentro da solução. Remova todo o líquido contendo células e transfira para um recipiente cônico de 15 ml (ou 50 ml se você estiver reunindo 3 ou mais frascos).

E. Usando técnica estéril, remova uma alíquota para contagem em um hemacitômetro.

F. Enquanto você conta as células, o restante da solução deve ser centrifugado na centrífuga clínica por 5 minutos a 1000 rpm.

4) Após calcular a contagem de células, separe as células em 2,5 x 10⁵ células por frasco com filtro T 25.

5) As células devem ser alimentadas a cada 2-3 dias com meio de crescimento fresco contendo 0,75 μg/ml de puromicina.

Congelamento:

As células devem ser congeladas a uma temperatura não inferior a 5x10⁵ células /ml/criotubo em meios de crescimento contendo 10% DMSO e 30% FBS sem puromicina e posteriormente colocada em uma câmara de congelamento de isopropanol a -80°C durante a noite. Transfira para o nitrogênio líquido no dia seguinte.

Wendy Norris