Protocolo para Cultura de Linfoblastos

Meio de crescimento

RPMI 1640 – TermoFisher # 11875
15% Soro Fetal Bovino (FBS) – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) Penicilina-Estreptomicina (opcional) – ThermoFisher #15140-122

Notas gerais

• O meio de crescimento deve ser sempre equilibrado na incubadora a 37°C, 5% CO₂ por 30 minutos antes de usar
• Use sempre frascos com tampas ventiladas
• Incube sempre o frasco na posição vertical
• Não deve ser usado mais de 20 ml em um frasco T25

Descongelando células congeladas

As células congeladas serão recebidas em alíquotas de 1 ml em gelo seco. Mantenha as células congeladas até descongelar para cultura celular ou coloque em armazenamento de nitrogênio líquido se não iniciar as culturas imediatamente. No entanto, é recomendado que, se você for armazenar as células para uso posterior, cultive estoques frescos e congele várias ampolas. As células são criopreservadas em 45% RPMI-1640, 50% FBS e 5% DMSO (grau de cultura de tecidos).

1. 1. Coloque 10 ml de soro bovino fetal (SFB) RPMI-1640, 15%, ± antibióticos em um frasco T-25 com tampa ventilada.
   2. Deixe a mídia equilibrar em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% CO₂ no ar por 30 minutos. Os frascos devem ser incubados em posição vertical.
   3. Descongele cada ampola ou frasco de células congeladas em banho-maria a 37 °C ou em um recipiente com água morna, uma de cada vez.
   4. Limpe rapidamente o exterior da ampola ou frasco com etanol 70%. Se as células estiverem em uma ampola de vidro, quebre cuidadosamente a ampola, certificando-se de proteger os dedos de vidro quebrado.
   5. Remova 1 ml de células congeladas com uma pipeta estéril e coloque em um frasco T-25 com 10 ml de meio. Rotule claramente o frasco para identificar cada linhagem celular.
   6. Coloque o frasco em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% CO₂ no ar. Os frascos devem ser incubados em posição vertical.
   7. Após 24 horas, retire 5 ml de meio da parte superior sem perturbar os linfócitos depositados no fundo do frasco e substitua por 5 ml de meio pré-aquecido.
   8. Prossiga com o protocolo de cultura de células linfoblásticas.

Cultura de linfoblastos

1. 1. Três a quatro dias após o descongelamento, conte as células. As células não são aderentes e crescem em aglomerados. Quebre os aglomerados com pipetagem suave.
   2. Contar células.
   3. Idealmente, a concentração celular não deve exceder 2 x 10⁶ células/ml.
   4. Dependendo da concentração celular, realimentar, dividir ou congelar as células.
   5. Realimente adicionando 5-6 ml de meio de crescimento equilibrado.
   6. Semeie novas culturas em pelo menos 2 x 10⁵ células/ml.
   7. As células devem ser congeladas em aproximadamente 5 x 10⁶ células/ml. Siga o protocolo de congelamento de células.

Linfoblastos Congelados

1. 1. As células devem ser congeladas em aproximadamente 5 x 10⁶ células/ml.
   2. Transfira o volume apropriado de células para um tubo cônico de 15 ou 50 ml.
   3. Centrifugar a 4°C a 100 xg por 10 minutos.
   4. Remova o meio e ressuspenda em volume apropriado de meio de congelamento frio.
   5. Transfira 1 ml de cada célula para o frasco criogênico.
   6. Coloque os criotubos na câmara de congelamento e deixe a câmara no congelador a -80°C durante a noite.
   7. Transfira os criotubos para nitrogênio líquido no dia seguinte.

Wendy Norris