Размораживание линий клеток PRF

1. Быстро разморозьте клетки на водяной бане при температуре 37˚C.
2. Протрите внешнюю поверхность флакона этанолом 70%.
3. Перенесите размороженные клетки в колбу Т25, содержащую 5 мл питательной среды.
4. Поместите колбу в инкубатор при температуре 37˚C на ночь.
5. На следующий день рассмотрите под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки прикрепились.
6. Удалите среду и замените ее свежей питательной средой.

Субкультивирование линий клеток PRF

1. При слиянии клетки следует разделить.
2. Чтобы разделить ячейки (приведенные объемы предполагают, что ячейки находятся в T25):
   a) Используя стерильную технику, удалите среду и промойте колбу 2-3 мл стерильного HBSS. Удалите и выбросьте HBSS.
   б) Добавьте 1 мл трипсина и инкубируйте в течение 2-3 минут. Клетки следует проверить под инвертированным микроскопом, чтобы определить, начали ли они округляться, подниматься и всплывать. Если клетки не отделяются через 3 минуты, можно инкубировать еще 1-2 минуты.
   c) Закрутите крышку и осторожно наклоните колбу из стороны в сторону, чтобы выбить все клетки. Колбу можно слегка постучать по бокам, чтобы высвободить клетки, если это необходимо.
   d) Добавьте 4 мл новой среды в колбу, как только клетки всплывут, чтобы инактивировать трипсин. Несколько раз промойте стенки колбы новой средой, чтобы смыть все клетки с пластика и перенести в раствор. Удалите всю жидкость, содержащую клетки, и перенесите в коническую колбу объемом 15 мл (или 50 мл, если вы объединяете 3 или более колб).
   д) Соблюдая стерильность, отберите аликвоту для подсчета на гемоцитометре.
   е) Пока вы подсчитываете клетки, оставшийся раствор следует центрифугировать в клинической центрифуге в течение 5 минут при 1000 об/мин.
3. После подсчета количества клеток, поместите клетки на чашку Петри в концентрации 2,5 х 10⁵ ячеек на колбу с фильтром T25.
4. Клетки следует подпитывать свежей питательной средой каждые 2–3 дня.

Замораживание:

Клетки следует замораживать при концентрации не менее 5 x 10⁵ клеток/мл/криопробирка в питательной среде, содержащей 10% DMSO и 30% FBS, а затем помещена в изопропаноловую морозильную камеру при -80˚C на ночь. Перенести в жидкий азот на следующий день.

Протокол субкультивирования и замораживания фибробластов