трипсин

Трипсин ЭДТА C .25% (Invitrogen#25200-056)

Сбалансированный солевой раствор Хэнка

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) хлорид кальция, (-) хлорид магния, (-) сульфат магния)

ДМСО для заморозки

ДМСО для клеточной культуры

Клетки будут доставлены замороженными на сухом льду в концентрации приблизительно 5 x 10⁵клетки/флакон

Протокол размораживания фибробластов

1. Быстро разморозьте клетки в водяной бане при температуре 37°C.
2. Протрите внешнюю поверхность флакона этанолом 70%.
3. Перенесите размороженные клетки в колбу Т25, содержащую 5 мл питательной среды без пуромицина.
4. Поместите колбу в инкубатор при температуре 37°C на ночь.
5. На следующий день рассмотрите под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки прикрепились.
6. Удалите среду и замените ее свежей питательной средой.

Субкультивирование линий клеток PRF

1) Когда клетки укоренятся и начнут расти, начните использовать среду, содержащую 0,75 мкг/мл пуромицина. Продолжайте поддерживать клетки в среде, содержащей 0,75 мкг/мл пуромицина.

2) Клетки следует разделить при слиянии.

3) Разделение ячеек (приведенные объемы предполагают, что ячейки находятся в Т25):

A. Используя стерильную технику, удалите среду и промойте колбу 2-3 мл стерильного HBSS. Удалите и выбросьте HBSS.

B. Добавьте 1 мл трипсина и инкубируйте в течение 2-3 минут. Клетки следует проверить под инвертированным микроскопом, чтобы определить, начали ли они округляться, подниматься и всплывать. Если клетки не отделяются через 3 минуты, можно инкубировать еще 1-2 минуты

C. Закрутите крышку и осторожно наклоните колбу из стороны в сторону, чтобы выбить все клетки. Колбу можно слегка постучать по бокам, чтобы высвободить клетки, если это необходимо.

D. Добавьте 4 мл новой среды в колбу, как только клетки всплывут, чтобы инактивировать трипсин. Несколько раз промойте стенки колбы новой средой, чтобы смыть все клетки с пластика и в раствор. Удалите всю жидкость, содержащую клетки, и перенесите в коническую колбу объемом 15 мл (или 50 мл, если вы объединяете 3 или более колб).

E. Используя стерильную технику, отберите аликвоту для подсчета на гемоцитометре.

F. Пока вы подсчитываете клетки, оставшийся раствор следует центрифугировать в клинической центрифуге в течение 5 минут при 1000 об/мин.

4) После подсчета количества клеток, поместите клетки на чашку Петри в концентрации 2,5 х 10⁵ ячеек на колбу с фильтром Т 25.

5) Клетки следует подпитывать каждые 2–3 дня свежей питательной средой, содержащей 0,75 мкг/мл пуромицина.

Замораживание:

Клетки следует замораживать при температуре не ниже 5x10⁵ клетки /мл/криопробирка в питательной среде содержащий 10% DMSO и 30% FBS без пуромицина и затем поместили в изопропаноловую морозильную камеру на ночь при температуре -80°C. Перенести в жидкий азот на следующий день.

Венди Норрис