1. Справочная информация по iPSC для неспециалистов

Стволовые клетки — это «незрелые» клетки, которые еще не стали превращаться в какой-либо один тип клеток. Они пластичны, поскольку обладают потенциалом развиваться во множество различных типов зрелых клеток в организме, например, в клетки, из которых состоят сердце или кровеносные сосуды, а также другие ткани и органы. В 2007 году исследователи открыли стратегию создания стволовых клеток в лабораторных условиях путем перепрограммирования зрелых взрослых клеток, которые мы обычно выращиваем для исследовательских целей.^{1, 2} . Эти искусственно созданные стволовые клетки называются индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками («iPSC»). Для области прогерии это огромный прорыв. Впервые ученые теперь могут создавать стволовые клетки прогерии и задавать вопросы о том, как стволовые клетки функционируют и развиваются при прогерии. Ранее не было источника человеческих стволовых клеток прогерии, и поэтому существовала нехватка информации о том, как функционируют стволовые клетки прогерии по сравнению со стволовыми клетками людей без прогерии. Кроме того, ученые могут перепрограммировать стволовые клетки прогерии, чтобы впервые создавать зрелые кровеносные сосуды прогерии, сердечные клетки и другие типы клеток. До сих пор не было источника человеческих клеток прогерии сердца или кровеносных сосудов.  Теперь мы можем задать ключ вопросы о сердечном заболевании, которое приводит к ранней смерти при прогерии от сердечных приступов и инсультов. Мы можем сравнить эти открытия с сердечным заболеванием и старением в общей популяции и узнать больше о том, что влияет на старение у всех нас. Уже было опубликовано несколько превосходных исследований с использованием стволовых клеток прогерии.^3-5  Наша цель в The Progeria Research Foundation — способствовать еще большему количеству открытий с помощью этого бесценного инструмента. Для получения информации о стволовых клетках посетите этот веб-сайт правительства США: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Цель создания и распространения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) Фондом исследований прогерии

Миссия Фонда исследований прогерии заключается в поиске методов лечения и излечения от синдрома прогерии Хатчинсона-Гилфорда и его заболеваний, связанных со старением. В 2009 году PRF начал сотрудничать с группой экспертов-ученых из Университета Торонто, Канада, под руководством доктора философии Уильяма Стэнфорда, чтобы создать высококачественные iPSC прогерии. Доктор Стэнфорд является заведующим кафедрой исследований в области интегративной биологии стволовых клеток в Канаде. С 2011 года PRF продолжает сотрудничать с доктором Стэнфордом из Университета Оттавы, Канада, где он является профессором клеточной и молекулярной медицины медицинского факультета и старшим научным сотрудником Центра исследований стволовых клеток им. Спротта при Научно-исследовательском институте больницы Оттавы.

Наша цель — предоставить этот бесценный инструмент исследователям по всему миру. Этот новый исследовательский инструмент будет использоваться для создания новых и инновационных исследований в области прогерии, а также ее связи с болезнями сердца и старением.  

3. Генерация плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), индуцированных синдромом прогерии Хатчинсона-Гилфорда

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) были получены с помощью VSVG-псевдотипированной ретровирусной трансдукции четырех человеческих факторов, Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc в фибробласты. Колонии iPSC были получены на мышиных эмбриональных фибробластах (MEF). Использованная процедура была в основном такой же, как описано ранее, но без использования репортера EOS (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Контроль качества: валидация и характеристика

Доступные в настоящее время линии прошли несколько этапов проверки (см. загружаемые PDF-файлы ниже):

5. Исходный материал, из которого были получены эти iPS-клетки

iPSC были получены из нетрансформированных линий фибробластов PRF Cell & Tissue Bank.

Для всех линий iPS использовался метод трансдукции с использованием ретровируса MKOS.

Идентификатор линии iPSC	Мутация	Пол и возраст донора	Исходный тип клетки кликните сюда.	Подтверждающие данные
HGADFN003 iPS 1B	LMNAЭкзон 11, 1824 г. С>Т	Мужчина 2 года 0 мес.	Дермальные фибробласты HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA экзон 11, 1824 г. С>Т	Мужчина 2 года 0 мес.	Дермальные фибробласты HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS1D	LMNA экзон 11, 1824 г. С>Т	Мужчина 2 года 0 мес.	Дермальные фибробласты HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA Экзон 11, 1824 C>T	Мальчик 8 лет 5 мес.	Дермальные фибробласты HGADFN167	167 л.с. 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA Экзон 11, 1824 C>T	Мальчик 8 лет 5 мес.	Дермальные фибробласты HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	Мать HGADFN167 (не затронута)	Женщина 37 лет 10 мес.	Дермальные фибробласты HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	Мать HGADFN167 (не затронута)	Женщина 37 лет 10 мес.	Дермальные фибробласты HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	Отец HGADFN167 (не затронут)	Мужчина 40 лет 5мес.	Дермальные фибробласты HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	Отец HGADFN167 (не затронут)	Мужчина 40 лет 5мес.	Дермальные фибробласты HGFDFN168	168 iPS1P

6. Подпишитесь на нашу рассылку, чтобы получать будущие обновления iPSC и новые клеточные линии.

Мы продолжаем генерировать линии iPSC. Если вы хотите получать периодические обновления о iPSC, хранящихся в PRF Cell & Tissue Bank, подпишитесь на нашу рассылку, нажав здесь

7. Вопросы?

По любым вопросам или в случае необходимости обращайтесь к Лесли Гордон, доктору медицины, доктору философии, медицинскому директору, по адресу lgordon@progeriaresearch.org или 978-535-2594

8. Заказ линий iPS-клеток

В 2014 году PRF ввела политику отсутствия изменений в нашем MTA. Это результат 12 лет договорных отношений с 70 исследовательскими группами, работающими в учреждениях в 14 странах. PRF и его консультанты учли вопросы, возникшие за этот период времени, и отредактировали соглашение соответствующим образом, что привело к тому, что мы считаем справедливыми и разумными условиями.

По вопросам, связанным с федеральными государственными учреждениями США, обращайтесь к Венди Норрис по адресу: wnorris@brownhealth.org или 401-274-1122 х 48063.

Шаг 1: Заполните заявку и соглашение о передаче материалов

Заявление и соглашение для негосударственных учреждений

Соглашение о передаче материалов для неправительственных организаций

Шаг 2: Верните заполненное заявление и соглашение о передаче материалов Венди Норрис по адресу wnorris@brownhealth.org. После одобрения вы получите электронное письмо с подтверждением вашего заказа и предполагаемой датой доставки. 

Шаг 3: Лаборатория доктора Стэнфорда в настоящее время распределяет линии в замороженных криопробирках. Его лаборатория отправит вам электронное письмо, когда культура будет отправлена, с информацией о доставке и отслеживании. Неопытным исследователям направляется пройти обучение на специализированных курсах, необходимых для работы с эмбриональными стволовыми клетками человека/iPSC.

Центр плюрипотентных стволовых клеток человека (руководитель д-р Стэнфорд) в Исследовательском институте больницы Оттавы предлагает виртуальное индивидуальное обучение основам методов культивирования iPSC, специфичных для клеточных линий iPSC Progeria. Варианты и формат обучения гибкие и зависят от уровня опыта ученых.  Для получения более подробной информации отправьте электронное письмо по адресу hpscf@ohri.ca.

Шаг 4: Университет Оттавы выставит вам счет напрямую за каждую линию iPSC, а также расходы на курьерскую доставку, если таковые имеются.

9. Подготовка среды для культивирования клеток HGPS и контрольных iPS

iPSC и ESC необходимо кормить mTeSR Plus от Stem Cell Technologies (cat# 5825). Пожалуйста, следуйте рекомендациям поставщика по хранению.

10. Подготовка пластин Матригеля

Примечание: Все действия с матригелем следует выполнять как можно быстрее и при этом оставлять его в максимально холодной воде.

1. Разморозьте бутылку Матригеля при температуре 4°С.°C. Проверьте сертификат анализа данной партии, чтобы узнать концентрацию белка.
2. Добавьте достаточное количество холодной среды DMEM/F12 к размороженному матригелю для достижения конечной концентрации 5 мг/мл.
3. Приготовьте аликвоты по 1 мл приготовленного на шаге 2 матригеля в предварительно охлажденных пробирках Falcon объемом 15 мл.
4. Заморозьте и храните все аликвоты при температуре -20°С.
5. Для приготовления матригелевых пластин отберите одну аликвоту матригеля (1 мл) из -20°C и добавьте 10 мл холодной DMEM/F12. Тщательно перемешайте, пока осадок не оттает (не создавая пузырьков и всегда сохраняя раствор холодным).
6. Перелейте в пробирку объемом 50 мл, затем добавьте 20 мл холодной среды DMEM/F12 (1 мл аликвоты Матригеля разбавьте в 30 мл среды DMEM/F12), тщательно перемешайте.
7. Планшет (1 мл/лунку для 6-луночного планшета, 0,5 мл/лунку для 12-луночного планшета, 0,25 мл/лунку для 24-луночного планшета). Убедитесь, что раствор покрывает всю поверхность, осторожно встряхивая планшет. Не замораживайте повторно остатки матригеля.
8. Если вы используете пластину немедленно, оставьте ее при комнатной температуре на 1 час (или на 30 минут при 37°C).°C), рассмотрите матригель под микроскопом. Матригель должен быть хорошо диспергирован и не «комковат».
9. Если вы используете пластины в другое время, оберните край пластины парафильмом и храните при температуре 4°С до 2 недель.

Матригель – BD/Fisher, cat#CB-40230

DMEM/F12 – Технологии жизни, кат. #11330-057

Доктор Уильям Стэнфорд-2022

11. Размораживание ES- или iPS-клеток (на криопробирку)

1. Достаньте чашку с матригелем из холодильника на 4°C и прогрейте при комнатной температуре в течение часа или приготовьте новую чашку с матригелем (см. протокол приготовления чашки с матригелем).
2. Нагрейте 4 мл mTeSR Plus в пробирке Falcon объемом 15 мл.
3. Извлеките клетки из резервуара с жидким азотом и вращайте в ванне с температурой 37°C, пока не останется только небольшой кусочек льда. Флакон должен оттаять через 1-2 минуты. Этот шаг нужно выполнить быстро.
4. Пробирку с этанолом и пробирку с питательной средой Falcon поместите в вытяжной шкаф.
5. Используйте 1 мл. широкий кончик рта, чтобы медленно добавьте клетки в 4 мл предварительно нагретой среды (избегайте перемешивания клеточной суспензии).
6. Вращение со скоростью 130 RCF в течение 5 минут.
7. Удалить супернатант.
8. Добавьте 2 мл среды PSC и с помощью широкого наконечника аккуратно разбейте комки. Перенесите среду в одну лунку 6-луночного планшета, добавьте 2 мкл ингибитора ROCK (Y27632, конечная концентрация 10 мкМ). Поместите в одну лунку, покрытую матригелем (6-луночного планшета).
9. Аккуратно встряхните клетки, чтобы равномерно распределить их, и поместите в гипоксический инкубатор (5%O₂, 10% CO₂). Избегайте повреждения планшета в течение 24 часов после посева.

   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно избегать чрезмерного разрушения комков или агрессивного пипетирования. Это может значительно снизить выживаемость. Клетки должны оставаться в кусках размером 100-300 клеток во время посева. Соблюдая осторожность, постарайтесь работать быстро после размораживания клеток, чтобы свести к минимуму время их контакта с криопротектором.

10. Удалите среду через 24 часа и добавьте 2 мл среды PSC (для 6-луночного планшета, 1 мл для 12-луночного и 0,5 мл для 24-луночного планшета). См. Сбор и уход за протоколом hESC/iPSC.

СМИ PSC

mTeSR Plus от Stem Cell Technologies (cat# 5825). Пожалуйста, следуйте рекомендациям поставщика по хранению.

Что такое ингибитор ROCK Y27632?

Ингибитор ROCK Y27632 является селективным ингибитором Rho-ассоциированной киназы p160 ROCK. Обработка ингибитором ROCK Y27632 предотвращает апоптоз, вызванный диссоциацией человеческих эмбриональных стволовых клеток (hESC) и человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), увеличивая выживаемость и поддерживая плюрипотентность во время субкультивирования и размораживания hESC и hiPSC. Также было показано, что ингибитор ROCK Y27632 повышает выживаемость стволовых клеток во время криоконсервации. Обратите внимание, что аликвоты ингибитора Rock чувствительны к свету и повторяющимся циклам замораживания-размораживания. Обязательно используйте эти аликвоты в течение рекомендуемого поставщиком срока годности.

Доктор Уильям Стэнфорд-2022

12. Сбор и уход за эмбриональными стволовыми клетками человека/индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками

1. На следующий день после размораживания клеток посмотрите на них под микроскопом, чтобы определить уровень выживаемости. ПРИМЕЧАНИЕ: нормально наблюдать большое количество неприкрепленных клеток. Пока некоторые клетки прикреплены, колонии могут возникнуть из них в течение 3–7 дней.
2. Удалите среду из лунок и пипетируйте 2 мл (для 6-луночного планшета, 1 мл для 12-луночного и 0,5 мл для 24-луночного планшета) свежей и теплой среды PSC на лунку. Верните планшет в инкубатор.
3. Клетки подпитываются до слияния 60-70% (следуйте рекомендациям поставщика).
4. Начиная со второго дня клетки следует осмотреть и очистить от любых дифференцированных клеток, которые могут расти.
5. Для очистки клеток используйте вытяжной колпак и соскребите дифференцированные клетки наконечником пипетки.
6. После очистки ячеек замените среду, как описано выше.

(См. Замораживание hESC/iPSC или Передача hESC/iPSC)

ПРИМЕЧАНИЕ:

Было установлено, что среда PSC более эффективна в гипоксической среде. Мы также наблюдали, что дифференциация клеток происходит реже, когда клетки выращиваются в гипоксических инкубаторах по сравнению с нормоксическими. Наконец, посеянные клетки имеют лучшую выживаемость при использовании гипоксического инкубатора.

Нормоксический: 37°С, 21% O₂, 5% CO₂

Гипоксия: 37°С, 5%O₂, 10% CO₂

Доктор Уильям Стэнфорд-2022

13. Прохождение hESC/iPSC

1. Добавьте 2 мл среды PSC в 6-луночный планшет, покрытый матригелем, и отставьте в сторону.
2. Возьмите планшет, подлежащий пассированию, удалите среду из лунки и промойте ее один раз 1 мл PBS(-/-).
3. Добавьте 1 мл раствора ЭДТА в лунку и оставьте на 3-4 минуты при комнатной температуре. Не перемещайте планшет, так как клетки могут начать отделяться.
4. Удалите раствор ЭДТА и добавьте 1 мл среды PSC. Не оставляйте ЭДТА на клетках более 4 минут, так как это приведет к их отрыву.
5. Соскребите клетки с помощью клеточного скребка и распределите клетки по 6 лункам планшета, содержащего среду PSC. Избегайте чрезмерного разбивания частей колонии и старайтесь быть осторожными при соскабливании. Постарайтесь сохранять клетки большими кусками. Используйте наконечник пипетки с широким горлом, чтобы разбить комки, если это необходимо. Чрезмерное разбивание клеток может привести к гибели клеток или чрезмерной спонтанной дифференциации после пассирования.
6. Инкубировать при 37°C после равномерного распределения клеток в каждой лунке (встряхивание в форме буквы «8» или L). Избегайте встряхивания планшета в течение 24 часов после пассирования.

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как клетки были соскоблены, их следует как можно скорее перенести на новый планшет, поскольку клетки быстро прикрепятся снова (в течение 5 минут).

Если оставить ЭДТА на клетках более чем на 4 минуты, клетки могут начать отделяться. Если это произойдет, просто соберите клетки в 15-миллилитровый falcon с 4 мл среды PSC. Центрифугируйте клетки при 130 rcf в течение 5 минут. Ресуспендируйте осадок с 1 мл среды и равномерно распределите по 6-луночному планшету, покрытому матригелем (160 мкл на лунку).

Раствор ЭДТА: Добавьте 500 мкл 0,5 М ЭДТА (pH 8,0) в 500 мл DPBS (-/-). Добавьте 0,9 г NaCl. Отфильтруйте раствор для стерилизации и храните его при температуре 4°C до 6 месяцев.

Из статьи:

Пассирование и расширение колоний человеческих плюрипотентных стволовых клеток методом безферментной диссоциации в химически определенных условиях культивирования

Жанетт Бирс,¹ Дэниел Р. Гулбрансон,^2,3 Николь Джордж,⁴Лорен И. Синискальки,¹ Джеффри Джонс,^4,5 Джеймс А. Томсон,^2,3,6 и Гуокай Чен^1,2

14. Замораживание эмбриональных стволовых клеток человека/ИПСК

1. Включите Bio-Cool (морозильник с контролируемой скоростью) и установите температуру -7°C.
2. Извлеките клетки из инкубатора и рассмотрите слияние и морфологию под микроскопом.
3. Если лунки слились с 70%, удалите старую среду и промойте один раз PBS(-/-), затем добавьте 1 мл раствора ЭДТА (см. пассаж с раствором ЭДТА) на лунку.
4. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 3–4 минут.
5. Аспирируйте раствор ЭДТА и добавьте 1 мл холодной среды mFreSR (cat#05855, Stem Cell Technologies).
6. Используйте клеточный скребок, чтобы осторожно поднять клетки. Держите клетки большими кусками, насколько это возможно, и избегайте пипетирования вверх и вниз.
7. Перенесите клетки/mFreSR в криопробирку с помощью широкого наконечника. Держите флаконы на льду до готовности к шагу 8.
8. Поместите пробирки в Bio-Cool и инкубируйте в течение 10 минут.
9. Получите жидкий азот.
10. Через 10 минут засейте клетки, окунув шпатель в жидкий азот и коснувшись им стенки криопробирки примерно на 10–30 секунд или до тех пор, пока на стенке криопробирки не образуется кристалл.
11. Запустите программу 1, нажав кнопку «PROG» и пройдя программу, снова нажав кнопку, вы должны увидеть скорость 0,5°C/мин., затем нажмите «RUN».
12. Как только температура достигнет -65°C, криопробирки можно переносить и хранить в жидком азоте.

Альтернативы

Другой вариант — поместить криопробирки в морозильный контейнер (Biocision-CoolCell) и хранить при температуре -80°C в течение ночи. На следующий день переместить криопробирки в жидкий азот (жидкую или паровую фазу).

Доктор Уильям Стэнфорд-2022