Протокол культивирования лимфобластов

Среда для роста

RPMI 1640 – Термофишер # 11875
15% Фетальная бычья сыворотка (ФБС) – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) Пенициллин-стрептомицин (опционально) – ThermoFisher #15140-122

Общие примечания

• Среду для выращивания всегда следует уравновешивать в инкубаторе при температуре 37°C, 5% CO₂ в течение 30 минут перед использованием
• Всегда используйте фляги с вентилируемыми крышками.
• Всегда инкубируйте колбу в вертикальном положении.
• В колбе T25 следует использовать не более 20 мл.

Размораживание замороженных клеток

Замороженные клетки будут получены в аликвотах по 1 мл на сухом льду. Держите клетки замороженными до размораживания для культивирования клеток или поместите в хранилище с жидким азотом, если не начинаете культивирование немедленно. Однако рекомендуется, если вы собираетесь хранить клетки для последующего использования, выращивать свежие запасы и замораживать несколько ампул. Клетки криоконсервируются в 45% RPMI-1640, 50% FBS и 5% DMSO (класс для культивирования тканей).

1. 1. Поместите 10 мл сыворотки плода крупного рогатого скота (FBS) RPMI-1640, 15% ± антибиотики в колбу Т-25 с вентилируемой крышкой.
   2. Дайте среде уравновеситься в увлажненном инкубаторе при температуре 37°C и 5% CO₂ на воздухе в течение 30 минут. Колбы следует инкубировать в вертикальном положении.
   3. Разморозьте каждую ампулу или флакон с замороженными клетками на водяной бане при температуре 37°C или в стакане с теплой водой, по одной за раз.
   4. Быстро очистите внешнюю поверхность ампулы или флакона этанолом 70%. Если клетки находятся в стеклянной ампуле, осторожно разбейте ампулу, защищая пальцы от осколков стекла.
   5. Извлеките 1 мл замороженных клеток стерильной пипеткой и поместите в колбу Т-25 с 10 мл среды. Четко промаркируйте колбу, чтобы идентифицировать каждую клеточную линию.
   6. Поместите колбу в инкубатор с увлажнением при температуре 37°C и 5% CO₂ на воздухе. Колбы следует инкубировать в вертикальном положении.
   7. Через 24 часа отберите 5 мл среды сверху, не трогая лимфоциты, осевшие на дне колбы, и замените 5 мл предварительно подогретой среды.
   8. Продолжайте работу с протоколом культивирования лимфобластных клеток.

Культура лимфобластов

1. 1. Через три-четыре дня после размораживания подсчитайте клетки. Клетки не прилипают и растут в комках. Разбейте комки осторожным пипетированием.
   2. Подсчитайте клетки.
   3. В идеале концентрация клеток не должна превышать 2 х 10⁶ клеток/мл.
   4. В зависимости от концентрации клеток повторно подпитывайте, разделяйте или замораживайте клетки.
   5. Повторно подкормите, добавив 5–6 мл уравновешенной питательной среды.
   6. Высевайте новые культуры не менее чем 2 x 10⁵ клеток/мл.
   7. Клетки следует замораживать примерно в концентрации 5 x 10⁶ клеток/мл. Соблюдайте протокол замораживания клеток.

Замораживание лимфобластов

1. 1. Клетки следует замораживать примерно в концентрации 5 x 10⁶ клеток/мл.
   2. Перенесите соответствующий объем клеток в коническую пробирку объемом 15 или 50 мл.
   3. Центрифугируйте при температуре 4°C и 100 xg в течение 10 минут.
   4. Удалите среду и ресуспендируйте в соответствующем объеме холодной замораживающей среды.
   5. Перенесите по 1 мл клеток в криопробирку.
   6. Поместите криопробирки в морозильную камеру и поставьте ее на ночь в морозильник с температурой -80°C.
   7. На следующий день перенесите криопробирки в жидкий азот.

Венди Норрис