1. விஞ்ஞானி அல்லாதவர்களுக்கான iPSC பின்னணி தகவல்

ஸ்டெம் செல்கள் "முதிர்ச்சியடையாத" செல்கள் ஆகும், அவை எந்த ஒரு உயிரணு வகையாக மாறுவதற்கு இன்னும் உறுதியளிக்கவில்லை. இதயம் அல்லது இரத்த நாளங்கள் மற்றும் பிற திசுக்கள் மற்றும் உறுப்புகளை உருவாக்கும் செல்கள் போன்ற உடலில் பல்வேறு வகையான முதிர்ந்த செல்களாக உருவாகும் திறன் இருப்பதால் அவை நெகிழ்வானவை. 2007 ஆம் ஆண்டில், ஆராய்ச்சி நோக்கங்களுக்காக நாம் பொதுவாக வளர்க்கும் முதிர்ந்த வயதுவந்த செல்களை மறுபிரசுரம் செய்வதன் மூலம் ஆய்வகத்தில் ஸ்டெம் செல்களை உருவாக்குவதற்கான உத்தியை ஆராய்ச்சியாளர்கள் கண்டுபிடித்தனர்.^{1, 2} . இந்த செயற்கையாக உருவாக்கப்பட்ட ஸ்டெம் செல்கள் Induced Pluripotent Stem Cells ("iPSCs") என்று அழைக்கப்படுகின்றன. புரோஜீரியா துறையில், இது ஒரு பெரிய திருப்புமுனை. முதன்முறையாக, விஞ்ஞானிகள் இப்போது ப்ரோஜீரியா ஸ்டெம் செல்களை உருவாக்கி, ப்ரோஜீரியாவில் ஸ்டெம் செல்கள் எவ்வாறு செயல்படுகின்றன மற்றும் உருவாகின்றன என்பதைப் பற்றிய கேள்விகளைக் கேட்கலாம். முன்னதாக மனித ப்ரோஜீரியா ஸ்டெம் செல்கள் எதுவும் இல்லை, எனவே புரோஜீரியா இல்லாதவர்களிடமிருந்து வரும் ஸ்டெம் செல்களுடன் ஒப்பிடும்போது புரோஜீரியா ஸ்டெம் செல்கள் எவ்வாறு செயல்படுகின்றன என்பது பற்றிய தகவல் இல்லை. கூடுதலாக, விஞ்ஞானிகள் முதன்முறையாக, முதிர்ந்த புரோஜீரியா இரத்த நாளங்கள், இதய செல்கள் மற்றும் பிற உயிரணு வகைகளை உருவாக்க புரோஜீரியா ஸ்டெம் செல்களை மீண்டும் நிரல் செய்யலாம். இப்போது வரை, மனித ப்ரோஜீரியா இதயம் அல்லது இரத்த நாள செல்கள் எதுவும் இல்லை.  நாம் இப்போது விசையை கேட்கலாம் மாரடைப்பு மற்றும் பக்கவாதத்தால் புரோஜீரியாவில் ஆரம்பகால மரணத்திற்கு வழிவகுக்கும் இதய நோய் பற்றிய கேள்விகள். இந்த கண்டுபிடிப்புகளை பொது மக்களில் உள்ள இதய நோய் மற்றும் முதுமையுடன் ஒப்பிடலாம் மற்றும் நம் அனைவருக்கும் வயதானதை பாதிக்கிறது என்பதைப் பற்றி மேலும் கண்டறியலாம். புரோஜீரியா ஸ்டெம் செல்களைப் பயன்படுத்தி ஏற்கனவே பல சிறந்த ஆய்வுகள் வெளியிடப்பட்டுள்ளன.^3-5  இந்த விலைமதிப்பற்ற கருவியைப் பயன்படுத்தி மேலும் பல கண்டுபிடிப்புகளை எளிதாக்குவதே ப்ரோஜீரியா ஆராய்ச்சி அறக்கட்டளையின் எங்கள் குறிக்கோள். ஸ்டெம் செல்கள் பற்றிய ப்ரைமருக்கு, இந்த அமெரிக்க அரசாங்க இணையதளத்தைப் பார்க்கவும்: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. புரோஜீரியா ஆராய்ச்சி அறக்கட்டளை மூலம் தூண்டப்பட்ட ப்ளூரிபோடென்ட் ஸ்டெம் செல் (iPSC) உருவாக்கம் மற்றும் விநியோகத்தின் நோக்கம்

புரோஜீரியா ஆராய்ச்சி அறக்கட்டளையின் நோக்கம் ஹட்சின்சன்-கில்ஃபோர்ட் ப்ரோஜீரியா நோய்க்குறி மற்றும் அதன் முதுமை தொடர்பான கோளாறுகளுக்கான சிகிச்சைகள் மற்றும் சிகிச்சையை கண்டுபிடிப்பதாகும். 2009 ஆம் ஆண்டில், உயர்தர புரோஜீரியா ஐபிஎஸ்சிகளை உருவாக்க, வில்லியம் ஸ்டான்போர்ட், பிஎச்டியின் வழிகாட்டுதலின் கீழ், கனடாவின் டொராண்டோ பல்கலைக்கழகத்தில் உள்ள நிபுணர்களின் நிபுணர் குழுவுடன் PRF ஒத்துழைத்தது. டாக்டர். ஸ்டான்போர்ட் ஒருங்கிணைந்த ஸ்டெம் செல் உயிரியலில் கனடா ஆராய்ச்சித் தலைவராக உள்ளார். 2011 ஆம் ஆண்டு நிலவரப்படி, கனடாவின் ஒட்டாவா பல்கலைக்கழகத்தில் டாக்டர் ஸ்டான்ஃபோர்டுடன் PRF தொடர்ந்து ஒத்துழைத்து வருகிறது, அங்கு அவர் செல்லுலார் மற்றும் மூலக்கூறு மருத்துவம், மருத்துவ பீடம் மற்றும் ஒட்டாவா மருத்துவமனை ஆராய்ச்சி நிறுவனத்தின் ஸ்ப்ராட் சென்டர் ஃபார் ஸ்டெம் செல் ஆராய்ச்சியில் மூத்த விஞ்ஞானி.

உலகெங்கிலும் உள்ள ஆராய்ச்சியாளர்களுக்கு இந்த விலைமதிப்பற்ற கருவியை வழங்குவதே எங்கள் குறிக்கோள். இந்த புதிய ஆராய்ச்சிக் கருவியானது ப்ரோஜீரியாவில் புதிய மற்றும் புதுமையான ஆராய்ச்சியை உருவாக்குவதற்கும், இதய நோய் மற்றும் முதுமைக்கும் அதன் உறவை உருவாக்குவதற்கும் பயன்படுத்தப்படும்.  

3. Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome Induced-Pluripotent Stem Cells (iPSCs) உருவாக்கம்

Induced-Pluripotent Stem Cells (iPSCs) VSVG-pseudotyped retroviral transduction எனும் நான்கு மனித காரணிகளான Oct4, Sox2, Klf4 மற்றும் c-Myc ஆகியவற்றை ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்களாகப் பயன்படுத்தி பெறப்பட்டது. iPSC காலனிகள் மவுஸ்-எம்பிரியோனிக் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்களில் (MEFகள்) பெறப்பட்டன. பயன்படுத்தப்பட்ட செயல்முறை அடிப்படையில் முன்பு விவரிக்கப்பட்டது, ஆனால் EOS நிருபரின் பயன்பாடு இல்லாமல் இருந்தது (நேச்சர் புரோட்டோகால்ஸ் 4: 1828-1844, 2009). 

4. தரக் கட்டுப்பாடு: சரிபார்த்தல் மற்றும் குணாதிசயம்

தற்போது கிடைக்கும் வரிகள் பல சரிபார்ப்பு படிகளுக்கு உட்பட்டுள்ளன (கீழே தரவிறக்கம் செய்யக்கூடிய PDFகளைப் பார்க்கவும்):

5. இந்த iPS செல்கள் பெறப்பட்ட அசல் தொடக்கப் பொருள்

iPSCகள் PRF செல் & திசு வங்கி மாற்றப்படாத ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட் செல் லைன்களில் இருந்து பெறப்பட்டது.

அனைத்து iPS வரிகளுக்கும் பயன்படுத்தப்படும் கடத்தும் முறை ரெட்ரோவைரஸ் MKOS ஆகும்.

iPSC வரி ஐடி	பிறழ்வு	பாலினம் மற்றும் நன்கொடை வயது	தொடக்க செல் வகை இங்கே கிளிக் செய்யவும்.	துணை தரவு
HGADFN003 iPS 1B	LMNAExon 11, 1824 C>T	ஆண் 2 வயது 0மா	டெர்மல் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	LMNA எக்ஸான் 11, 1824 C>T	ஆண் 2 வயது 0மா	டெர்மல் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS 1D	LMNA எக்ஸான் 11, 1824 C>T	ஆண் 2 வயது 0மா	டெர்மல் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	LMNA எக்ஸான் 11, 1824 C>T	ஆண் 8 வயது 5 மாதங்கள்	டெர்மல் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	LMNA எக்ஸான் 11, 1824 C>T	ஆண் 8 வயது 5 மாதங்கள்	டெர்மல் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	HGADFN167 இன் தாய் (பாதிக்கப்படவில்லை)	பெண் 37 வயது 10மா	டெர்மல் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	HGADFN167 இன் தாய் (பாதிக்கப்படவில்லை)	பெண் 37 வயது 10மா	டெர்மல் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	HGADFN167 இன் தந்தை (பாதிக்கப்படவில்லை)	ஆண் 40 வயது 5 மாதங்கள்	டெர்மல் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	HGADFN167 இன் தந்தை (பாதிக்கப்படவில்லை)	ஆண் 40 வயது 5 மாதங்கள்	டெர்மல் ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள் HGFDFN168	168 iPS1P

6. எதிர்கால iPSC புதுப்பிப்புகள் மற்றும் புதிய செல் வரிகளுக்கு எங்கள் மின்னஞ்சல் பட்டியலில் சேரவும்

நாங்கள் தொடர்ந்து iPSC வரிகளை உருவாக்கி வருகிறோம். PRF செல் & திசு வங்கியில் நடைபெறும் iPSCகள் குறித்த அவ்வப்போது புதுப்பிப்புகளை நீங்கள் விரும்பினால், கிளிக் செய்வதன் மூலம் எங்கள் மின்னஞ்சல் பட்டியலில் சேரவும் இங்கே

7. கேள்விகள்?

லெஸ்லி கார்டன், MD, PhD, மருத்துவ இயக்குனர், ஏதேனும் கேள்விகள் அல்லது தேவைகளுக்கு, இல் தொடர்பு கொள்ளவும் lgordon@progeriaresearch.org அல்லது 978-535-2594

8. iPS செல் வரிகளை ஆர்டர் செய்தல்

2014 இல், PRF எங்கள் MTA இல் எந்த மாற்றமும் இல்லை என்ற கொள்கையை நிறுவியது. இது 14 நாடுகளில் உள்ள நிறுவனங்களில் பணிபுரியும் 70 ஆராய்ச்சி குழுக்களுடன் 12 வருட ஒப்பந்த ஏற்பாடுகளின் விளைவாகும். PRF மற்றும் அதன் ஆலோசகர்கள் அந்தக் காலகட்டத்தில் எழுந்த சிக்கல்களைக் கருத்தில் கொண்டு, அதற்கேற்ப ஒப்பந்தத்தைத் திருத்தியுள்ளனர், இதன் விளைவாக நியாயமான மற்றும் நியாயமான விதிமுறைகள் என்று நாங்கள் கருதுகிறோம்.

அமெரிக்க மத்திய அரசு நிறுவனங்கள் அல்லது கேள்விகளுக்கு, தயவுசெய்து வெண்டி நோரிஸை இங்கு தொடர்பு கொள்ளவும்: wnorris@brownhealth.org அல்லது 401-274-1122 x 48063.

படி 1: விண்ணப்பம் மற்றும் பொருள் பரிமாற்ற ஒப்பந்தத்தை முடிக்கவும்

அரசு சாரா நிறுவனங்களுக்கான விண்ணப்பம் மற்றும் ஒப்பந்தம்

அரசு சாரா நிறுவனங்களுக்கான பொருள் பரிமாற்ற ஒப்பந்தம்

படி 2: பூர்த்தி செய்யப்பட்ட விண்ணப்பம் மற்றும் பொருள் பரிமாற்ற ஒப்பந்தத்தை வெண்டி நோரிஸிடம் திருப்பி அனுப்பவும் wnorris@brownhealth.org. அங்கீகரிக்கப்பட்டதும், உங்கள் ஆர்டரையும், எதிர்பார்க்கப்படும் ஷிப்பிங் தேதியையும் உறுதிப்படுத்தும் மின்னஞ்சலைப் பெறுவீர்கள். 

படி 3: டாக்டர். ஸ்டான்ஃபோர்டின் ஆய்வகம் தற்போது உறைந்த கிரையோவியல்களில் வரிகளை விநியோகித்து வருகிறது. கலாச்சாரம் அனுப்பப்பட்டதும், ஷிப்பிங் மற்றும் டிராக்கிங் தகவலுடன் அவரது ஆய்வகம் உங்களுக்கு மின்னஞ்சல் அனுப்பும். அனுபவமற்ற ஆராய்ச்சியாளர்கள் மனித கரு ஸ்டெம் செல்/ஐபிஎஸ்சி வேலைகளுக்கு அவசியமான சிறப்புப் படிப்புகளில் பயிற்சி பெறுமாறு அறிவுறுத்தப்படுகிறார்கள்.

ஒட்டாவா மருத்துவமனை ஆராய்ச்சி நிறுவனத்தில் உள்ள மனித ப்ளூரிபோடென்ட் ஸ்டெம் செல் வசதி (டாக்டர். ஸ்டான்ஃபோர்டால் இயக்கப்பட்டது) புரோஜீரியா iPSC செல் லைன்களுக்கு குறிப்பிட்ட iPSC கலாச்சார நுட்பங்களின் அடிப்படைகள் குறித்து மெய்நிகர் ஒருவருக்கு ஒருவர் பயிற்சி அளிக்கிறது. விஞ்ஞானிகளின் அனுபவத்தின் அளவைப் பொறுத்து பயிற்சி விருப்பங்கள் மற்றும் வடிவம் நெகிழ்வானது.  மேலும் தகவலுக்கு, hpscf@ohri.ca ஐ மின்னஞ்சல் செய்யவும்.

படி 4: ஒட்டாவா பல்கலைக்கழகம் ஒவ்வொரு iPSC லைனுக்கும் கூரியர் செலவுகள் ஏதேனும் இருந்தால் நேரடியாக உங்களுக்கு இன்வாய்ஸ் செய்யும்.

9. HGPS மற்றும் கட்டுப்பாடு iPS செல் கலாச்சார ஊடக தயாரிப்பு

iPSC மற்றும் ESCகளுக்கு ஸ்டெம் செல் டெக்னாலஜிஸ் (cat# 5825) மூலம் mTeSR பிளஸ் வழங்கப்பட வேண்டும். சேமிப்பகத்திற்கான சப்ளையரின் பரிந்துரைகளைப் பின்பற்றவும்.

10. மேட்ரிஜெல் தட்டுகளைத் தயாரித்தல்

குறிப்பு: மேட்ரிஜெல் சம்பந்தப்பட்ட அனைத்து நடவடிக்கைகளும் முடிந்தவரை விரைவாக செய்யப்பட வேண்டும் மற்றும் முடிந்தவரை குளிர்ச்சியாக இருக்க வேண்டும்.

1. 4 மணிக்கு மெட்ரிகல் பாட்டில் கரைக்கவும்°C. அதன் புரதச் செறிவைக் கண்டறிய, அதன் பகுப்பாய்வுச் சான்றிதழைச் சரிபார்க்கவும்.
2. 5mg/mL என்ற இறுதி செறிவை அடைய, கரைந்த மேட்ரிஜலில் போதுமான குளிர் DMEM/F12 மீடியாவைச் சேர்க்கவும்.
3. 15மிலி ஃபால்கன் ட்யூப்களில் முன் குளிரூட்டப்பட்ட 15மிலி ஃபால்கன் ட்யூப்களில் படி 2 இலிருந்து தயாரிக்கப்பட்ட மேட்ரிஜலின் 1மிலி அலிகோட்களை உருவாக்கவும்.
4. அனைத்து அலிகோட்களையும் -20 இல் உறைய வைத்து சேமிக்கவும்°சி.
5. மேட்ரிஜல் தட்டுகளை உருவாக்க, -20 இலிருந்து ஒரு அல்கோட் மேட்ரிஜலை (1mL) அகற்றவும்°C மற்றும் 10mL குளிர் DMEM/F12 ஐ சேர்க்கவும். உருண்டைகள் கரையும் வரை நன்கு கலக்கவும் (குமிழிகளை உருவாக்காமல், கரைசலை எப்போதும் குளிர்ச்சியாக வைத்திருங்கள்).
6. 50மிலி குழாயிற்கு மாற்றி, பின்னர் 20மிலி குளிர்ந்த DMEM/F12 (1mL மேட்ரிஜெல் அலிகோட் 30mL DMEM/F12ல் நீர்த்தப்படுகிறது), நன்றாக கலக்கவும்.
7. தட்டு (6 கிணறு தட்டுக்கு 1mL/கிணறு, 12 கிணறு தட்டுக்கு 0.5mL/கிணறு, 24 கிணறு தட்டுக்கு 0.25mL/கிணறு). தட்டை மெதுவாக அசைப்பதன் மூலம் தீர்வு முழு மேற்பரப்பையும் உள்ளடக்கியது என்பதை உறுதிப்படுத்தவும். எஞ்சியிருக்கும் மேட்ரிஜலை மீண்டும் உறைய வைக்க வேண்டாம்.
8. தட்டை உடனடியாகப் பயன்படுத்தினால், தட்டு அறை வெப்பநிலையில் 1 மணிநேரம் (அல்லது 37 மணிக்கு 30 நிமிடங்கள்) இருக்கட்டும்°சி), நுண்ணோக்கின் கீழ் மேட்ரிஜலைக் கவனிக்கவும். Matrigel நன்றாக சிதறி "குருதியாக" இருக்கக்கூடாது.
9. மற்றொரு நேரத்தில் தட்டுகளைப் பயன்படுத்தினால், தட்டின் விளிம்பை பாராஃபில்ம் மூலம் போர்த்தி 4 இல் சேமிக்கவும்°2 வாரங்கள் வரை சி.

Matrigel - BD/Fisher, cat#CB-40230

DMEM/F12 – Life Technologies, cat#11330-057

டாக்டர். வில்லியம் ஸ்டான்போர்ட்-2022

11. தாவிங் ES அல்லது iPS செல்கள் (ஒரு கிரையோ-குப்பிக்கு)

1. 4 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் ஒரு மேட்ரிகல் தட்டை எடுத்து அறை வெப்பநிலையில் ஒரு மணி நேரம் சூடுபடுத்தவும் அல்லது புதிய மேட்ரிஜல் பிளேட்டை உருவாக்கவும் (மேட்ரிகல் தட்டு நெறிமுறையைத் தயாரிப்பதைப் பார்க்கவும்).
2. 15 மில்லி ஃபால்கன் குழாயில் 4mL mTeSR பிளஸ் சூடு.
3. திரவ நைட்ரஜன் தொட்டியில் இருந்து செல்களை அகற்றி, ஒரு சிறிய பனிக்கட்டி மட்டும் எஞ்சியிருக்கும் வரை 37°C குளியலறையில் சுழற்றவும். குப்பியை 1-2 நிமிடங்களில் கரைக்க வேண்டும். இந்த நடவடிக்கை விரைவாக செய்யப்பட வேண்டும்.
4. எத்தனால் செல் குழாய் மற்றும் பால்கன் மீடியா குழாய் மற்றும் பேட்டையில் வைக்கவும்.
5. 1 மிலி பயன்படுத்தவும் அகலமான வாய் முனை மெதுவாக 4mL ப்ரீ-வார்ம் மீடியாவில் செல்களைச் சேர்க்கவும் (செல் சஸ்பென்ஷனைக் கலப்பதைத் தவிர்க்கவும்).
6. 5 நிமிடங்களுக்கு 130 rcf இல் சுற்றவும்.
7. மேலோட்டத்தை அகற்றவும்.
8. 2mL PSC மீடியாவைச் சேர்க்கவும், மேலும் பரந்த வாய் முனையுடன் கொத்துக்களை மெதுவாக உடைக்கவும். 6 கிணறு தகட்டின் ஒரு கிணற்றிற்கு மீடியாவை மாற்றவும், 2uL ROCK இன்ஹிபிட்டரைச் சேர்க்கவும் (Y27632, இறுதி செறிவு 10uM). நன்கு பூசப்பட்ட ஒரு மேட்ரிஜலில் தட்டு (6 கிணறு தட்டு).
9. செல்களை சமமாக விநியோகிக்க பாறை செல்களை மெதுவாக நகர்த்தி, ஹைபோக்சிக் இன்குபேட்டரில் வைக்கவும் (5%O₂, 10% CO₂) விதைத்த 24 மணிநேரத்திற்கு தட்டுத் தொல்லையைத் தவிர்க்கவும்.

   குறிப்பு: கொத்துகள் அல்லது ஆக்கிரமிப்பு குழாய்கள் அதிகமாக உடைவதைத் தவிர்ப்பது மிகவும் முக்கியம். இது உயிர்வாழும் விகிதத்தை கணிசமாகக் குறைக்கும். விதைப்பு நேரத்தில் செல்கள் 100-300 செல்கள் பெரிய துண்டுகளாக இருக்க வேண்டும். மென்மையாக இருக்கும்போது, ​​​​செல்கள் கரைந்தவுடன் விரைவாக வேலை செய்ய முயற்சிக்கவும், அவை கிரையோபுரோடெக்டண்டுடன் தொடர்பு கொள்ளும் நேரத்தைக் குறைக்கவும்.

10. 24 மணிநேரத்திற்குப் பிறகு மீடியாவை அகற்றி, 2mL PSC மீடியாவைச் சேர்க்கவும் (6 கிணற்றுக்கு 1mL, 12 கிணற்றுக்கு 1mL மற்றும் 24 கிணறு தட்டுக்கு 0.5mL). ஹெச்இஎஸ்சி/ஐபிஎஸ்சி நெறிமுறைக்கான அறுவடை மற்றும் பராமரிப்பைப் பார்க்கவும்.

PSC ஊடகம்

ஸ்டெம் செல் டெக்னாலஜிஸிலிருந்து mTeSR பிளஸ் (cat# 5825). சேமிப்பகத்திற்கான சப்ளையரின் பரிந்துரைகளைப் பின்பற்றவும்.

ராக் இன்ஹிபிட்டர் ஒய்27632 என்றால் என்ன?

ROCK இன்ஹிபிட்டர் Y27632 என்பது Rho தொடர்புடைய கைனேஸ் p160 ROCK இன் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட தடுப்பானாகும். ROCK இன்ஹிபிட்டர் Y27632 உடனான சிகிச்சையானது மனித கரு ஸ்டெம் செல்கள் (HESC) மற்றும் மனித தூண்டப்பட்ட ப்ளூரிபோடென்ட் ஸ்டெம் செல்கள் (iPSC) ஆகியவற்றின் விலகல் தூண்டப்பட்ட அப்போப்டொசிஸைத் தடுக்கிறது, உயிர்வாழும் விகிதத்தை அதிகரிக்கிறது மற்றும் HESCகள் மற்றும் hiPSC களின் துணை சாகுபடி மற்றும் உருகும்போது ப்ளூரிபோடென்சியை பராமரிக்கிறது. ராக் இன்ஹிபிட்டர் ஒய்27632, கிரையோபிரெசர்வேஷனின் போது ஸ்டெம் செல்கள் உயிர்வாழும் விகிதத்தை மேம்படுத்துவதாகவும் காட்டப்பட்டுள்ளது. ராக் இன்ஹிபிட்டர் அலிகோட்கள் ஒளி மற்றும் மீண்டும் மீண்டும் உறைதல் கரைப்பு சுழற்சிகளுக்கு உணர்திறன் கொண்டவை என்பதை நினைவில் கொள்க. சப்ளையரின் பரிந்துரைக்கப்பட்ட அடுக்கு வாழ்க்கைக்குள் இந்த அலிகோட்களைப் பயன்படுத்துவதை உறுதிசெய்யவும்.

டாக்டர். வில்லியம் ஸ்டான்போர்ட்-2022

12. HESC/ iPSC க்கான அறுவடை மற்றும் பராமரிப்பு

1. உயிரணுக்கள் கரைக்கப்பட்ட மறுநாள், உயிர்வாழும் விகிதத்தை தீர்மானிக்க நுண்ணோக்கின் கீழ் அவற்றைப் பாருங்கள். குறிப்பு: அதிக எண்ணிக்கையிலான இணைக்கப்படாத செல்களைக் கவனிப்பது இயல்பானது. சில செல்கள் இணைக்கப்பட்டிருக்கும் வரை, 3 - 7 நாட்களுக்குள் அவற்றிலிருந்து காலனிகள் உருவாகலாம்.
2. கிணறுகளில் இருந்து மீடியாவை அகற்றி, ஒரு கிணற்றுக்கு 2 மில்லி (6 கிணறுக்கு 1mL, 12 கிணறுக்கு 1mL மற்றும் 24 கிணறுகள் தட்டுக்கு 0.5mL) புதிய மற்றும் சூடான PSC மீடியாவை ஒரு கிணற்றில் வைக்கவும். இன்குபேட்டருக்கு தட்டு திரும்பவும்.
3. கலங்கள் 60-70% சங்கமம் வரை உணவளிக்கப்படும் (சப்ளையர் பரிந்துரைகளைப் பின்பற்றவும்).
4. 2 ஆம் நாள் வரை, செல்கள் வளர்ச்சியடையக்கூடிய வேறுபட்ட செல்களைக் கவனித்து சுத்தம் செய்ய வேண்டும்.
5. செல்களை சுத்தம் செய்ய, பிக்கிங் ஹூட்டைப் பயன்படுத்தவும் மற்றும் பைப்பெட் முனை மூலம் வேறுபட்ட செல்களை துடைக்கவும்.
6. செல்கள் சுத்தம் செய்யப்பட்டவுடன், மேலே உள்ள படிகளில் செய்தது போல் மீடியாவை மாற்றவும்.

(ஃப்ரீஸிங் ஹெச்இஎஸ்சி/ஐபிஎஸ்சி அல்லது பாஸ்ஸிங் ஹெச்இஎஸ்சி/ஐபிஎஸ்சியைப் பார்க்கவும்)

குறிப்பு:

பிஎஸ்சி மீடியா ஒரு ஹைபோக்சிக் சூழலில் மிகவும் திறமையானதாக தீர்மானிக்கப்பட்டது. நார்மோக்ஸிக் மற்றும் ஹைபோக்சிக் இன்குபேட்டர்களில் செல்கள் வளர்க்கப்படும்போது குறைவான வேறுபாடு ஏற்படுவதையும் நாங்கள் கவனித்தோம். கடைசியாக, ஹைபோக்சிக் இன்குபேட்டரைப் பயன்படுத்தும் போது விதை செல்கள் சிறந்த உயிர்வாழும் வீதத்தைக் கொண்டுள்ளன.

நார்மோக்ஸிக்: 37°சி, 211டிபி3டி ஓ₂, 5% CO₂

ஹைபோக்சிக்: 37°சி, 5%O₂, 10% CO₂

டாக்டர். வில்லியம் ஸ்டான்போர்ட்-2022

13. ஹெச்இஎஸ்சி/ஐபிஎஸ்சி தேர்ச்சி

1. 2mL PSC மீடியாவை 6 நன்கு மேட்ரிகல் பூசப்பட்ட தட்டில் சேர்த்து ஒதுக்கி வைக்கவும்.
2. கடந்து செல்ல வேண்டிய தட்டை எடுத்து, கிணற்றிலிருந்து மீடியாவை அகற்றி, 1mL PBS(-/-) கொண்டு ஒருமுறை கழுவவும்.
3. கிணற்றில் 1mL EDTA கரைசலை சேர்த்து, அறை வெப்பநிலையில் 3-4 நிமிடங்கள் விடவும். செல்கள் பிரிக்கத் தொடங்கும் என்பதால் தட்டைச் சுற்றி நகர்த்த வேண்டாம்.
4. EDTA கரைசலை அகற்றி 1mL PSC மீடியாவைச் சேர்க்கவும். 4 நிமிடங்களுக்கு மேல் செல்களில் EDTAவை விடாதீர்கள், ஏனெனில் இது செல்களை உயர்த்திவிடும்.
5. செல் ஸ்கிராப்பரைப் பயன்படுத்தி செல்களைத் துடைத்து, PSC மீடியாவைக் கொண்ட உங்கள் தட்டின் 6 கிணறுகளுக்கு இடையே செல்களைப் பிரிக்கவும். காலனி துண்டுகளை அதிகமாக உடைப்பதைத் தவிர்க்கவும், ஸ்கிராப்பிங்கில் மென்மையாக இருக்க முயற்சிக்கவும். செல்களை பெரிய துண்டுகளாக வைக்க முயற்சிக்கவும். தேவைப்பட்டால் கொத்துக்களை உடைக்க பரந்த வாய் பைப்பெட் நுனியைப் பயன்படுத்தவும். செல்களை அதிகமாக உடைப்பது உயிரணு இறப்பை ஏற்படுத்தலாம் அல்லது கடந்து சென்றதைத் தொடர்ந்து அதிகப்படியான தன்னிச்சையான வேறுபாட்டை ஏற்படுத்தலாம்.
6. 37 இல் அடைகாக்கும்°சி ஒவ்வொரு கிணற்றிலும் செல்களை சமமாக விநியோகித்த பிறகு (8 உருவம் அல்லது எல் வடிவ குலுக்கல்). கடந்து சென்ற 24 மணிநேரத்திற்கு தட்டுத் தொல்லையைத் தவிர்க்கவும்.

குறிப்பு: செல்கள் ஸ்கிராப் செய்யப்பட்டவுடன், அவற்றை விரைவில் புதிய தட்டுக்கு மாற்ற வேண்டும், ஏனெனில் செல்கள் விரைவாக மீண்டும் இணைக்கப்படும் (5 நிமிடங்களுக்குள்).

EDTA ஆனது 4 நிமிடங்களுக்கு மேல் செல்களில் இருந்தால், செல்கள் பிரிக்கத் தொடங்கும். இது நடந்தால், 4mL PSC மீடியாவுடன் 15mL ஃபால்கனில் செல்களை சேகரிக்கவும். 130 rcf இல் 5 நிமிடங்களுக்கு செல்களை சுழற்றவும். 1mL மீடியாவுடன் பெல்லட்டை மீண்டும் இணைத்து, 6 கிணறு மேட்ரிஜல் பூசப்பட்ட தகடு (ஒரு கிணற்றுக்கு 160uL) இடையே சமமாகப் பிரிக்கவும்.

EDTA தீர்வு: 500mL DPBS இல் (-/-) 500uL 0.5M EDTA (pH 8.0) ஐ சேர்க்கவும். NaCl 0.9 கிராம் சேர்க்கவும். கிருமி நீக்கம் செய்ய கரைசலை வடிகட்டி, 4 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 6 மாதங்கள் வரை சேமிக்கவும்.

காகிதத்தில் இருந்து:

வேதியியல் ரீதியாக வரையறுக்கப்பட்ட கலாச்சார நிலைகளில் என்சைம் இல்லாத விலகல் மூலம் மனித ப்ளூரிபோடென்ட் ஸ்டெம் செல்களை கடந்து செல்வது மற்றும் காலனி விரிவாக்கம்

ஜீனெட் பியர்ஸ்,¹ டேனியல் ஆர். குல்பிரான்சன்,^2,3 நிக்கோல் ஜார்ஜ்,⁴லாரன் ஐ. சினிஸ்கால்ச்சி,¹ ஜெஃப்ரி ஜோன்ஸ்,^4,5 ஜேம்ஸ் ஏ. தாம்சன்,^2,3,6 மற்றும் குகாய் சென்^1,2

14. முடக்கம் HESC/iPSC

1. பயோ-கூல் (கட்டுப்படுத்தப்பட்ட விகித உறைவிப்பான்) ஆன் செய்து வெப்பநிலையை -7 டிகிரி செல்சியஸுக்கு சரிசெய்யவும்.
2. இன்குபேட்டரிலிருந்து செல்களை அகற்றி, நுண்ணோக்கியின் கீழ் சங்கமம் மற்றும் உருவ அமைப்பைக் கவனிக்கவும்.
3. கிணறுகள் 70% சங்கமமாக இருந்தால், பழைய மீடியாவை அகற்றி, பிபிஎஸ்(-/-) மூலம் ஒருமுறை கழுவவும், பின்னர் ஒரு கிணற்றுக்கு 1 மில்லி ஈடிடிஏ கரைசலை (ஈடிடிஏ கரைசலுடன் அனுப்புவதைப் பார்க்கவும்) சேர்க்கவும்.
4. அறை வெப்பநிலையில் 3-4 நிமிடங்கள் அடைகாக்கவும்.
5. EDTA கரைசலை ஆஸ்பிரேட் செய்து, 1 மில்லி குளிர் mFreSR மீடியாவைச் சேர்க்கவும் (cat#05855, ஸ்டெம் செல் டெக்னாலஜிஸ்).
6. செல்களை மெதுவாக உயர்த்த செல் ஸ்கிராப்பரைப் பயன்படுத்தவும். செல்களை கூடுமானவரை பெரிய துண்டுகளாக வைத்து, மேலும் கீழும் குழாயைத் தவிர்க்கவும்.
7. பரந்த வாய் நுனியைப் பயன்படுத்தி செல்கள்/mFreSR ஐ கிரையோட்யூப்புக்கு மாற்றவும். படி 8 க்கு தயாராகும் வரை குப்பிகளை பனியில் வைக்கவும்.
8. குழாய்களை பயோ-கூலில் வைத்து 10 நிமிடங்கள் அடைகாக்கவும்.
9. திரவ நைட்ரஜனைப் பெறுங்கள்.
10. 10 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு, ஒரு ஸ்பேட்டூலாவை திரவ நைட்ரஜனில் நனைத்து, கிரையோ-குப்பியின் பக்கத்தைத் தொட்டு தோராயமாக 10-30 வினாடிகள் அல்லது கிரையோ-குப்பியின் பக்கத்தில் ஒரு படிக வடிவத்தைக் காணும் வரை செல்களை விதைக்கவும்.
11. "PROG" பொத்தானை அழுத்துவதன் மூலம் நிரல் 1 ஐத் தொடங்கவும், மேலும் பொத்தானை மீண்டும் அழுத்துவதன் மூலம் நிரலின் வழியாகச் செல்லவும், நீங்கள் 0.5°C/min வீதத்தைக் காண வேண்டும். , பின்னர் "RUN" ஐ அழுத்தவும்.
12. வெப்பநிலை -65 டிகிரி செல்சியஸ் அடைந்தவுடன், கிரையோ-குழாய்களை திரவ நைட்ரஜனில் மாற்றலாம் மற்றும் சேமிக்கலாம்.

மாற்றுகள்

மற்றொரு விருப்பம், கிரையோ-குழாய்களை உறைய வைக்கும் கொள்கலனில் (பயோசிஷன்-கூல்செல்) வைத்து இரவில் -80 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் சேமித்து வைப்பதாகும். அடுத்த நாள் கிரையோ-குழாய்களை திரவ நைட்ரஜனுக்கு (திரவ அல்லது நீராவி கட்டம்) நகர்த்தவும்.

டாக்டர். வில்லியம் ஸ்டான்போர்ட்-2022