1. Довідкова інформація iPSC для ненауковців

Стовбурові клітини — це «незрілі» клітини, які ще не встигли перетворитися на один тип клітин. Вони гнучкі, тому що мають потенціал для розвитку багатьох різних типів зрілих клітин в організмі, таких як клітини, які складають серце або кровоносні судини, а також інші тканини та органи. У 2007 році дослідники виявили стратегію створення стовбурових клітин у лабораторії шляхом перепрограмування зрілих дорослих клітин, які ми зазвичай вирощуємо для дослідницьких цілей.^{1, 2} . Ці штучно створені стовбурові клітини називаються індукованими плюрипотентними стовбуровими клітинами («iPSC»). Для сфери прогерії це величезний прорив. Вперше вчені тепер можуть виробляти стовбурові клітини прогерії та ставити запитання про те, як функціонують і розвиваються стовбурові клітини прогерії. Раніше не було джерела людських стовбурових клітин прогерії, і тому не було інформації про те, як функціонують стовбурові клітини прогерії порівняно зі стовбуровими клітинами людей без прогерії. Крім того, вчені можуть перепрограмувати стовбурові клітини прогерії, щоб уперше створити зрілі кровоносні судини, клітини серця та інші типи клітин прогерії. До цих пір не було джерел людських прогерійних клітин серця або кровоносних судин.  Тепер ми можемо запитати ключ питання про захворювання серця, які призводять до ранньої смерті прогерії від інфарктів та інсультів. Ми можемо порівняти ці відкриття з серцевими захворюваннями та старінням населення в цілому та дізнатися більше про те, що впливає на старіння кожного з нас. Вже було опубліковано кілька чудових досліджень із застосуванням стовбурових клітин Progeria.^3-5  Наша мета в The Progeria Research Foundation — сприяти багатьом новим відкриттям за допомогою цього безцінного інструменту. Для ознайомлення зі стовбуровими клітинами відвідайте веб-сайт уряду США: https://stemcells.nih.gov/info/basics.htm

2. Мета створення та розповсюдження індукованих плюрипотентних стовбурових клітин (iPSC) The Progeria Research Foundation

Місія The Progeria Research Foundation полягає в тому, щоб знайти способи лікування та лікування синдрому прогерії Хатчінсона-Гілфорда та розладів, пов’язаних зі старінням. У 2009 році PRF розпочав співпрацю з експертною командою вчених з Університету Торонто, Канада, під керівництвом доктора філософії Вільяма Стенфорда, щоб створити високоякісні iPSC Progeria. Доктор Стенфорд є науковою кафедрою Канади з інтегративної біології стовбурових клітин. З 2011 року PRF продовжує співпрацювати з доктором Стенфордом в Університеті Оттави, Канада, де він є професором клітинної та молекулярної медицини на медичному факультеті та старшим науковим співробітником Центру досліджень стовбурових клітин Спротта при Оттавській лікарні.

Наша мета — надати цей безцінний інструмент дослідникам у всьому світі. Цей новий дослідницький інструмент буде використано для проведення нових та інноваційних досліджень прогерії, а також її зв’язку із захворюваннями серця та старінням.  

3. Генерація плюрипотентних стовбурових клітин, індукованих синдромом прогерії Хатчінсона-Гілфорда (iPSC)

Індуковані плюрипотентні стовбурові клітини (iPSC) були отримані за допомогою VSVG-псевдотипованої ретровірусної трансдукції чотирьох факторів людини, Oct4, Sox2, Klf4 і c-Myc у фібробласти. Колонії iPSC були отримані на ембріональних фібробластах миші (MEF). Використана процедура була, по суті, такою, як описано раніше, але без використання репортера EOS (Nature Protocols 4: 1828-1844, 2009). 

4. Контроль якості: валідація та характеристика

Рядки, які наразі доступні, пройшли кілька етапів перевірки (див. PDF-файли для завантаження нижче):

5. Вихідний вихідний матеріал, з якого були отримані ці клітини iPS

iPSC були отримані з нетрансформованих клітинних ліній фібробластів PRF Cell & Tissue Bank.

Методом трансдукції, використаним для всіх ліній iPS, був Retrovirus MKOS.

ID лінії iPSC	Мутація	Стать і вік пожертвування	Тип вихідної клітини Натисніть тут.	Допоміжні дані
HGADFN003 iPS 1B	LMNAЕкзон 11, 1824 C>T	Чоловік 2 роки 0 міс	Дермальні фібробласти HGADFN003	003 iPS1B
HGADFN003 iPS 1C	Екзон 11 LMNA, 1824 C>T	Чоловік 2 роки 0 міс	Дермальні фібробласти HGADFN003	003 iPS1C
HGDFN003 iPS 1D	Екзон 11 LMNA, 1824 C>T	Чоловік 2 роки 0 міс	Дермальні фібробласти HGADFN003	003 iPS1D
HGADFN167 iPS 1J	Екзон 11 LMNA, 1824 C>T	Чоловік 8 років 5 міс	Дермальні фібробласти HGADFN167	167 PS 1J
HGADFN167 iPS 1Q	Екзон 11 LMNA, 1824 C>T	Чоловік 8 років 5 міс	Дермальні фібробласти HGADFN167	167 iPS1Q
HGMDFN090 iPS 1B	Мати HGADFN167 (не уражена)	Жінка 37 років 10 міс	Дермальні фібробласти HGMDFN090	090 iPS1B
HGMDFN090 iPS 1C	Мати HGADFN167 (не уражена)	Жінка 37 років 10 міс	Дермальні фібробласти HGMDFN090	090 iPS1C
HGFDFN168 iPS1 D2	Батько HGADFN167 (не впливає)	Чоловік 40р 5 міс	Дермальні фібробласти HGFDFN168	168 iPS1 D2
HGFDFN168 iPS1P	Батько HGADFN167 (не впливає)	Чоловік 40р 5 міс	Дермальні фібробласти HGFDFN168	168 iPS1P

6. Приєднуйтесь до нашого списку електронної пошти для майбутніх оновлень iPSC та нових ліній клітин

Ми продовжуємо створювати лінії iPSC. Якщо ви хочете періодично отримувати оновлення щодо iPSC, які зберігаються в PRF Cell & Tissue Bank, приєднайтеся до нашого списку розсилки, натиснувши тут

7. Запитання?

З будь-якими запитаннями чи потребами звертайтеся до Леслі Гордона, доктора медичних наук, медичного директора за адресою lgordon@progeriaresearch.org або 978-535-2594

8. Замовлення клітинних ліній iPS

У 2014 році PRF запровадила політику незмінності нашого MTA. Це результат 12 років контрактів із 70 дослідницькими групами, які працюють в установах у 14 країнах. PRF та його радник взяли до уваги проблеми, які виникли в той період часу, і відповідно відредагували угоду, в результаті чого ми вважаємо справедливими та розумними умови.

З питань федеральних державних установ США або запитань звертайтеся до Венді Норріс за адресою: wnorris@brownhealth.org або 401-274-1122 x 48063.

Крок 1. Заповніть заявку та угоду про передачу матеріалів

Заява та договір для недержавних установ

Договір про передачу матеріалів для недержавних установ

Крок 2: Поверніть заповнену заявку та угоду про передачу матеріалів Венді Норріс за адресою wnorris@brownhealth.org. Після схвалення ви отримаєте електронний лист із підтвердженням вашого замовлення та очікуваною датою доставки. 

крок 3: Лабораторія доктора Стенфорда зараз розповсюджує лінії в заморожених кріопробірках. Його лабораторія надішле вам електронний лист, коли культуру буде доставлено, з інформацією про доставку та відстеження. Недосвідчених дослідників направляють на навчання на спеціалізованих курсах, необхідних для роботи з ембріональними стовбуровими клітинами людини/iPSC.

Центр плюрипотентних стовбурових клітин людини (під керівництвом доктора Стенфорда) в Дослідницькому інституті лікарні Оттави пропонує віртуальне індивідуальне навчання основам методів культивування iPSC, характерних для клітинних ліній Progeria iPSC. Варіанти та формат навчання є гнучкими залежно від рівня досвіду науковців.  Для отримання додаткової інформації, будь ласка, надішліть електронну пошту на hpscf@ohri.ca.

Крок 4: Університет Оттави виставлятиме вам рахунок безпосередньо за кожну лінію iPSC плюс витрати на кур’єрську службу, якщо такі є.

9. Підготовка середовищ для культури клітин HGPS і Control iPS

iPSC та ESC потрібно годувати mTeSR Plus від Stem Cell Technologies (cat# 5825). Дотримуйтеся рекомендацій постачальника щодо зберігання.

10. Підготовка матригелевих пластин

Примітка: Усі кроки, пов’язані з матригелем, слід виконувати якомога швидше та залишатися якомога холоднішим.

1. Розморозьте пляшку матригелю при 4°C. Перевірте сертифікат аналізу цієї партії, щоб визначити концентрацію білка.
2. Додайте достатньо холодного середовища DMEM/F12 до розмороженого матригелю, щоб досягти кінцевої концентрації 5 мг/мл.
3. Зробіть аліквоти по 1 мл підготовленого матригелю зі стадії 2 у попередньо охолоджені пробірки Falcon об’ємом 15 мл.
4. Заморозьте та зберігайте всі аліквоти при -20°C.
5. Щоб зробити пластини з матригелем, видаліть одну аліквоту матригелю (1 мл) з -20°C і додайте 10 мл холодного DMEM/F12. Добре перемішайте, поки гранули не розморозяться (без утворення бульбашок і завжди тримайте розчин холодним).
6. Перенесіть у пробірку на 50 мл, потім додайте 20 мл холодного DMEM/F12 (1 мл аліквоти матригелю розводять у 30 мл DMEM/F12), добре перемішайте.
7. Планшет (1 мл/лунка для 6-лункового планшета, 0,5 мл/лунка для 12-лункового планшета, 0,25 мл/лунка для 24-лункового планшета). Переконайтеся, що розчин покриває всю площу поверхні, обережно струснувши пластину. Не заморожуйте повторно залишки матригелю.
8. Якщо ви використовуєте тарілку негайно, дайте їй постояти при кімнатній температурі протягом 1 години (або 30 хвилин при 37°В), спостерігайте матригель під мікроскопом. Матригель повинен добре розсіюватися і не «збиватися».
9. Якщо використовувати пластини в інший час, оберніть край пластини парафільмом і зберігайте при 4°C до 2 тижнів.

Matrigel – BD/Fisher, cat#CB-40230

DMEM/F12 – Life Technologies, cat#11330-057

Доктор Вільям Стенфорд-2022

11. Розморожування клітин ES або iPS (на кріопробірку)

1. Вийміть пластину матригелю з температури 4°C і нагрійте її при кімнатній температурі протягом однієї години або зробіть нову пластину матригелю (див. протокол підготовки пластини матригелю).
2. Нагрійте 4 мл mTeSR Plus у пробірці Falcon на 15 мл.
3. Вийміть клітини з резервуара з рідким азотом і перемішайте у бані при 37°C, доки не залишиться невеликий шматочок льоду. Флакон повинен розморозитися за 1-2 хвилини. Цей крок потрібно зробити швидко.
4. Пробірку з етанолом і пробірку із середовищем Falcon помістіть у витяжку.
5. Використовуйте 1 мл широкий кінчик рота, щоб повільно додайте клітини до 4 мл попередньо підігрітого середовища (уникайте змішування клітинної суспензії).
6. Віджимайте при 130 rcf протягом 5 хвилин.
7. Видалити супернатант.
8. Додайте 2 мл середовища PSC широкою горловиною обережно розбийте грудки. Перенесіть середовище в одну лунку 6-лункового планшета, додайте 2 мкл інгібітора ROCK (Y27632, кінцева концентрація 10 мкМ). Планшет в одну покриту матригелем лунку (6-лунковий планшет).
9. Обережно покачайте клітини, щоб рівномірно розподілити їх, і помістіть в гіпоксичний інкубатор (5%O).₂, 10% CO₂). Уникайте порушення пластини протягом 24 годин після посіву.

   ПРИМІТКА: Дуже важливо уникати надмірного руйнування грудок або агресивного піпетування. Це може значно знизити виживаність. На момент посіву клітини повинні залишатися у вигляді шматків по 100-300 клітин. Будьте обережні, але намагайтеся працювати швидко, коли клітини розморожені, щоб мінімізувати час їхнього контакту з кріопротектором.​

10. Видаліть середовище через 24 години та додайте 2 мл середовища PSC (для 6-лункового планшета, 1 мл для 12-лункового та 0,5 мл для 24-лункового планшета). Див. Збір і догляд за протоколом hESC/iPSC.

ЗМІ PSC

mTeSR Plus від Stem Cell Technologies (cat# 5825). Дотримуйтеся рекомендацій постачальника щодо зберігання.

Що таке інгібітор ROCK Y27632?

Інгібітор ROCK Y27632 є селективним інгібітором Rho-асоційованої кінази p160 ROCK. Лікування інгібітором ROCK Y27632 запобігає індукованому дисоціацією апоптозу ембріональних стовбурових клітин людини (hESC) і індукованих плюрипотентних стовбурових клітин людини (iPSC), збільшуючи рівень виживання та підтримуючи плюрипотентність під час субкультивування та розморожування hESC і hiPSC. Показано також, що інгібітор ROCK Y27632 підвищує рівень виживання стовбурових клітин під час кріоконсервації. Зауважте, що аліквоти інгібіторів породи чутливі до світла та повторюваних циклів заморожування та відтавання. Обов’язково використовуйте ці аліквоти протягом терміну придатності, рекомендованого постачальником.

Доктор Вільям Стенфорд-2022

12. Збирання та догляд за hESC/iPSC

1. Наступного дня після розморожування клітин подивіться на них під мікроскопом, щоб визначити рівень виживання. ПРИМІТКА: спостерігати велику кількість неприкріплених клітин – це нормально. Поки деякі клітини прикріплені, колонії можуть виникати з них протягом 3-7 днів.
2. Вийміть середовище з лунок і прокапайте 2 мл (для 6-лункового, 1 мл для 12-лункового та 0,5 мл для 24-лункового планшета) свіжого та теплого середовища PSC на лунку. Поверніть планшет в інкубатор.
3. Клітини подають до злиття 60-70% (дотримуйтеся рекомендацій постачальника).
4. Починаючи з 2-го дня, слід спостерігати за клітинами та очистити їх від будь-яких диференційованих клітин, які можуть рости.
5. Щоб очистити клітини, використовуйте ковпак для збирання та зіскрібайте диференційовані клітини наконечником піпетки.
6. Після очищення клітин змініть середовище, як це було зроблено в описаних вище кроках.

(Див. Заморожування hESC/iPSC або Проходження hESC/iPSC)

ПРИМІТКА:

Було визначено, що середовище PSC є більш ефективним у гіпоксичному середовищі. Ми також спостерігали, що менша диференціація відбувається, коли клітини вирощуються в гіпоксичних інкубаторах порівняно з нормоксичними. Нарешті, посіяні клітини мають кращий рівень виживання при використанні гіпоксичного інкубатора.

Нормоксик: 37°C, 21% O₂, 5% CO₂

Гіпоксичний: 37°C, 5%O₂, 10% CO₂

Доктор Вільям Стенфорд-2022

13. Проходження hESC/iPSC

1. Додайте 2 мл середовища PSC у 6-лунковий планшет, покритий матригелем, і відставте.
2. Візьміть планшет для пасування, видаліть середовище з лунки та промийте один раз 1 мл PBS (-/-).
3. Додайте в лунку 1 мл розчину EDTA і залиште на 3-4 хвилини при кімнатній температурі. Не рухайте пластину, оскільки клітини можуть почати від’єднуватися.
4. Видаліть розчин ЕДТА та додайте 1 мл середовища PSC. Не залишайте EDTA на клітинах більше ніж на 4 хвилини, оскільки це призведе до відриву клітин.
5. Зішкрібте клітини за допомогою скребка для клітин і розподіліть клітини між 6 лунками планшета, що містить середовище PSC. Уникайте надмірного роздроблення частинок колонії та намагайтеся обережно зішкрібати. Намагайтеся зберігати клітини великими шматками. Використовуйте наконечник піпетки з широким отвором, щоб розбити грудки, якщо необхідно. Надмірне розщеплення клітин може спричинити загибель клітин або надмірну спонтанну диференціацію після пасажу.
6. Висиджувати при 37°C після рівномірного розподілу клітин у кожній лунці (8 цифр або L-подібне струшування). Уникайте порушення пластини протягом 24 годин після пасажу.

ПРИМІТКА: Після того, як клітини зіскоблено, потрібно якнайшвидше перенести їх на нову пластину, оскільки клітини швидко приєднаються знову (протягом 5 хвилин).

Якщо EDTA залишити на клітинах більше 4 хвилин, клітини можуть почати відшаровуватися. Якщо це станеться, просто зберіть клітини в 15 мл Falcon з 4 мл середовища PSC. Обертайте клітини при 130 rcf протягом 5 хвилин. Ресуспендуйте осад з 1 мл середовища та рівномірно розподіліть між 6-лунковим планшетом, покритим матригелем (160 мкл на лунку).

Розчин ЕДТА: додайте 500 мкл 0,5 М ЕДТА (pH 8,0) у 500 мл DPBS (-/-). Додайте 0,9 г NaCl. Відфільтруйте розчин для стерилізації та зберігайте його при 4°C до 6 місяців.

З паперу:

Пасування та розширення колоній плюрипотентних стовбурових клітин людини шляхом безферментної дисоціації в хімічно визначених умовах культивування

Жанетт Бірс,¹ Деніел Р. Гулбрансон,^2,3 Ніколь Джордж,⁴Лорен І. Сініскальчі,¹ Джеффрі Джонс,^4,5 Джеймс А. Томсон,^2,3,6 і Гуокай Чен^1,2

14. Заморожування hESC/iPSC

1. Увімкніть Bio-Cool (морозильна камера з контрольованою швидкістю) і встановіть температуру до -7°C.
2. Вийміть клітини з інкубатора та спостерігайте злиття та морфологію під мікроскопом.
3. Якщо лунки конфлюентні 70%, видаліть старе середовище та промийте один раз PBS (-/-), а потім додайте 1 мл розчину EDTA (див. пропускання з розчином EDTA) у кожну лунку.
4. Інкубуйте при кімнатній температурі 3-4 хвилини.
5. Аспіруйте розчин ЕДТА та додайте 1 мл холодного середовища mFreSR (cat#05855, Stem Cell Technologies).
6. Використовуйте скребок для клітин, щоб обережно підняти клітини. Зберігайте клітини великими шматками, наскільки це можливо, і уникайте піпетування вгору та вниз.
7. Перенесіть клітини/mFreSR у кріопробірку за допомогою широкого горловини. Тримайте флакони на льоду до готовності до кроку 8.
8. Помістіть пробірки в Bio-Cool та інкубуйте протягом 10 хвилин.
9. Отримати рідкий азот.
10. Через 10 хвилин посійте клітини, зануривши шпатель у рідкий азот і торкнувшись краю кріопробирки протягом приблизно 10-30 секунд або поки не побачите кристали на стороні кріопробирки.
11. Запустіть програму 1, натиснувши кнопку «PROG», і пройдіть програму, натиснувши кнопку ще раз, і ви побачите швидкість 0,5°C/хв. , а потім натисніть «RUN».
12. Коли температура досягне -65°C, кріопробірки можна буде переносити та зберігати в рідкому азоті.

Альтернативи

Інший варіант – помістити кріопробірки в контейнер для заморожування (Biocision-CoolCell) і зберігати при -80°C протягом ночі. Перемістіть кріопробірки в рідкий азот (рідка або парова фаза) наступного дня.

Доктор Вільям Стенфорд-2022