胰蛋白酶

胰蛋白酶 EDTA C.25%（Invitrogen#25200-056）

汉克平衡盐溶液

HBSS-（Invitrogen#14170 (1X) (-) 氯化钙、(-) 氯化镁、(-) 硫酸镁）

DMSO 冷冻

细胞培养级 DMSO

细胞将以大约 5 x 10⁵细胞/小瓶

解冻成纤维细胞的方案

1. 在 37°C 水浴中快速解冻细胞。
2. 使用 70% 乙醇擦拭小瓶外部。
3. 将解冻的细胞转移到含有 5 ml 不含嘌呤霉素的生长培养基的 T25 烧瓶中。
4. 将烧瓶放入 37°C 培养箱中过夜。
5. 第二天，在显微镜下观察，确保细胞已经附着。
6. 除去培养基并换上新鲜的生长培养基。

PRF 细胞系传代培养

1) 当细胞建立并生长时，开始使用含有 0.75 μg/ml 嘌呤霉素的培养基。继续在含有 0.75 μg/ml 嘌呤霉素的培养基中维持细胞。

2) 细胞汇合后应分裂。

3) 分裂细胞（给出的体积假设细胞在T25中）：

A. 使用无菌技术，取出培养基并用 2-3 ml 无菌 HBSS 冲洗烧瓶。取出并丢弃 HBSS。

B. 加入 1 ml 胰蛋白酶，孵育 2-3 分钟。应在倒置显微镜下检查细胞是否已开始变圆、升起和漂浮。如果 3 分钟后细胞仍未脱落，可以再孵育 1-2 分钟

C. 拧紧瓶盖，轻轻地左右倾斜烧瓶，使所有细胞脱落。如有必要，可轻轻敲击烧瓶一侧，使细胞松动。

D. 细胞浮起后立即向烧瓶中加入 4 毫升新培养基，以灭活胰蛋白酶。用新培养基多次冲洗烧瓶壁，将所有细胞从塑料上洗掉并洗入溶液中。取出所有含有细胞的液体，然后转移到 15 毫升锥形瓶中（或 50 毫升，如果您要汇集 3 个或更多烧瓶）。

E. 使用无菌技术，取出一部分样品，用血细胞计数器进行计数。

F. 当您计数细胞时，应将剩余溶液放入临床离心机中以 1000 rpm 的速度旋转 5 分钟。

4) 计算细胞数量后，以 2.5 x 10⁵ 每个T25过滤顶瓶含有100个细胞。

5) 每2-3天应用含有0.75 μg/ml嘌呤霉素的新鲜生长培养基喂养细胞。

冷冻：

细胞应冷冻在不少于 5x 10⁵ 细胞/毫升/冷冻管 在生长培养基中 含有 10% DMSO 和 30% FBS 不含嘌呤霉素 随后放入-80°C 异丙醇冷冻室过夜。第二天转移到液氮中。

温迪·诺里斯